化学物質のシグナルかく乱作用を基にした新規in vitro催奇形性評価原理の解明

現行の動物を用いた催奇形性試験は、種差による検出感度の低さゆえに人的・時間的・金銭的コストがかかる。そのため、長年使用されてきた化学物質や低生産量の化学物質は、十分に催奇形性が評価されないまま使用されているのが現状である。この問題を解決するために、ヒトの発生毒性を高精度かつハイスループットで評価可能な動物試験代替法の開発が期待されている。これまでに我々は胎児が少数のシグナル伝達の相互作用により精巧に形作られることに着目し、化学物質によるFGFシグナルのかく乱作用の動的変化に基づいた、ヒトiPS細胞を用いた新規のin vitro催奇形性検出法を開発してきた。本法はリアルタイムルシフェレースアッセイを用いて、FGFシグナルのかく乱作用を評価することで、高い正確度とスループット性を実現している。本研究では、試験法の検出感度の向上及び分子機構の解明を目的とする。本年度は、FGF以外のシグナルとして、Wnt、TGF-b(Activin)、BMPのレポーター細胞を樹立した。WntシグナルはTCF/LEF transcriptional response elementを、TGF-β (Activin)シグナルはSmad binding elementを、BMPシグナルはBMP response elementを用い、それぞれの下流でNanoLucを発現するレポーターコンストラクトをAAVS1 locusにノックインした。また、リアルタイムルシフェレースアッセイ法の改良も行った。従来の24時間の定点測定法に代わって、60時間以上の連続した連続測定法を開発した。

現行の動物を用いた催奇形性試験は、種差による検出感度の低さゆえに人的・時間的・金銭的コストがかかる。そのため、長年使用されてきた化学物質や低生産量の化学物質は、十分に催奇形性が評価されないまま使用されているのが現状である。この問題を解決するために、ヒトの発生毒性を高精度かつハイスループットで評価可能な動物試験代替法の開発が期待されている。これまでに我々は胎児が少数のシグナル伝達の相互作用により精巧に形作られることに着目し、化学物質によるFGFシグナルのかく乱作用の動的変化に基づいた、ヒトiPS細胞を用いた新規のin vitro催奇形性検出法を開発してきた。本法はリアルタイムルシフェレースアッセイを用いて、FGFシグナルのかく乱作用を評価することで、高い正確度とスループット性を実現している。本研究では、試験法の検出感度の向上及び分子機構の解明を目的とする。本年度は、FGF以外のシグナルとして、Wnt、TGF-b(Activin)、BMPのレポーター細胞を樹立した。WntシグナルはTCF/LEF transcriptional response elementを、TGF-β (Activin)シグナルはSmad binding elementを、BMPシグナルはBMP response elementを用い、それぞれの下流でNanoLucを発現するレポーターコンストラクトをAAVS1 locusにノックインした。また、リアルタイムルシフェレースアッセイ法の改良も行った。従来の24時間の定点測定法に代わって、60時間以上の連続した連続測定法を開発した。