ヒト染色体のDNA複製開始点の単離とそれに作用するタンパク質の同定

分离人类染色体的 DNA 复制起点并鉴定作用于其的蛋白质

基本信息

批准号：
04256216
负责人：
釣本敏樹
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1992
资助国家：
日本
起止时间：
1992 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.試験管内複製反応を使用して、ヒト染色体上の複製開始点の検索を行なった。まず検索の対象としてヒト第10染色体、約350kb領域を選び、約10kbに断片化したプラスミドライブラリーを作成した。このライブラリーDNAを鋳型として、ヒト細胞粗抽出液、あるいはヒト細胞由来の精製された複製タンパク質とSV40ウイルスT抗原を使ってDNA合成開始領域をマップしたところ、挿入されたヒトDNAの特定の複製反応を行なわせたところ、精製した複製タンパク質を使用した反応において、有為に高いDNA合成能を有するクローンを数個得た。これらの部位から合成が開始していることが分かった。今後は高い複製能を持つプラスミドを複製開始点の候補として、複製必須領域の極小化を行ない複製開始に必要なDNA構造の解折を行なう予定である。2.上記の反応では、DNA合成に必要なDNAヘリカーゼ活性はSV40ウイルスT抗原に依存している。従がって染色体の複製反応で使われる細胞由来のDNAヘリカーゼは未同定である。そこで染色複製に関与するDNAヘリカーゼを検索するために、複製に使われるDNAヘリカーゼトDNAポリメラーゼはお互いに相互作用することに着目した。具体的には、抗DNAポリメラーゼα抗体カラムにポリメラーゼと共に結合するタンパク質分画の中からDNAヘリカーゼ活性の探した。この結果、ユニークなDNAヘリカーゼ活性を検出することができた。このDNAヘリカーゼは、DNAポリメラーゼαと相互作用性を持つことが期待され、その特性を解折を行なって、実際に上記の複製開始点の候補プラスミドの複製反応を進めるかどうかを検討している。

1。使用体外复制反应来寻找人类染色体复制的起源。首先，选择人类10号染色体区域作为搜索目标，并创建了一个质粒文库，其中获得了约10 kb的碎片。使用此库DNA作为模板，使用人类细胞原油提取物或源自人类细胞和SV40病毒T抗原的纯化复制蛋白来映射DNA合成启动区域。当对插入的人DNA进行特定的复制反应时，使用纯化的复制蛋白在反应中获得了高度合成DNA的几个克隆。发现合成从这些地点开始。将来，我们计划使用具有高复制能力的质粒作为复制起点的候选者，最大程度地减少所需的复制区域，并破译启动复制所需的DNA结构。 2。在上述反应中，DNA合成所需的DNA解旋酶活性取决于SV40病毒T抗原。因此，尚未鉴定出用于染色体复制反应中的细胞来源的DNA解旋酶。因此，我们专注于相互染色和复制的DNA解旋酶的相互作用，以寻找参与染色和复制的DNA解旋酶。具体而言，从与聚合酶与抗DNA聚合酶α抗体柱结合的蛋白质级分中搜索DNA解旋酶活性。结果，可以检测到独特的DNA解旋酶活性。预计该DNA解旋酶与DNA聚合酶α具有相互作用，并且正在分解其特性，以确定是否实际进行候选质粒的复制反应作为上述复制起点的复制反应。