ヒト染色体のDNA複製開始点の単離とそれに作用するタンパク質の同定

1.試験管内複製反応を使用して、ヒト染色体上の複製開始点の検索を行なった。まず検索の対象としてヒト第10染色体、約350kb領域を選び、約10kbに断片化したプラスミドライブラリーを作成した。このライブラリーDNAを鋳型として、ヒト細胞粗抽出液、あるいはヒト細胞由来の精製された複製タンパク質とSV40ウイルスT抗原を使ってDNA合成開始領域をマップしたところ、挿入されたヒトDNAの特定の複製反応を行なわせたところ、精製した複製タンパク質を使用した反応において、有為に高いDNA合成能を有するクローンを数個得た。これらの部位から合成が開始していることが分かった。今後は高い複製能を持つプラスミドを複製開始点の候補として、複製必須領域の極小化を行ない複製開始に必要なDNA構造の解折を行なう予定である。2.上記の反応では、DNA合成に必要なDNAヘリカーゼ活性はSV40ウイルスT抗原に依存している。従がって染色体の複製反応で使われる細胞由来のDNAヘリカーゼは未同定である。そこで染色複製に関与するDNAヘリカーゼを検索するために、複製に使われるDNAヘリカーゼトDNAポリメラーゼはお互いに相互作用することに着目した。具体的には、抗DNAポリメラーゼα抗体カラムにポリメラーゼと共に結合するタンパク質分画の中からDNAヘリカーゼ活性の探した。この結果、ユニークなDNAヘリカーゼ活性を検出することができた。このDNAヘリカーゼは、DNAポリメラーゼαと相互作用性を持つことが期待され、その特性を解折を行なって、実際に上記の複製開始点の候補プラスミドの複製反応を進めるかどうかを検討している。

1.試験管内複製反応を使用して、ヒト染色体上の複製開始点の検索を行なった。まず検索の対象としてヒト第10染色体、約350kb領域を選び、約10kbに断片化したプラスミドライブラリーを作成した。このライブラリーDNAを鋳型として、ヒト細胞粗抽出液、あるいはヒト細胞由来の精製された複製タンパク質とSV40ウイルスT抗原を使ってDNA合成開始領域をマップしたところ、挿入されたヒトDNAの特定の複製反応を行なわせたところ、精製した複製タンパク質を使用した反応において、有為に高いDNA合成能を有するクローンを数個得た。これらの部位から合成が開始していることが分かった。今後は高い複製能を持つプラスミドを複製開始点の候補として、複製必須領域の極小化を行ない複製開始に必要なDNA構造の解折を行なう予定である。2.上記の反応では、DNA合成に必要なDNAヘリカーゼ活性はSV40ウイルスT抗原に依存している。従がって染色体の複製反応で使われる細胞由来のDNAヘリカーゼは未同定である。そこで染色複製に関与するDNAヘリカーゼを検索するために、複製に使われるDNAヘリカーゼトDNAポリメラーゼはお互いに相互作用することに着目した。具体的には、抗DNAポリメラーゼα抗体カラムにポリメラーゼと共に結合するタンパク質分画の中からDNAヘリカーゼ活性の探した。この結果、ユニークなDNAヘリカーゼ活性を検出することができた。このDNAヘリカーゼは、DNAポリメラーゼαと相互作用性を持つことが期待され、その特性を解折を行なって、実際に上記の複製開始点の候補プラスミドの複製反応を進めるかどうかを検討している。