蛋白質燐酸化反応と障害神経細胞での軸索とシナプス再形成に関する分子生物学的研究

损伤神经元蛋白质磷酸化及轴突和突触再生的分子生物学研究

基本信息

批准号：
09280229
负责人：
山本秀幸
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

平成8年度にPC12細胞のCaMキナーゼIIについて検討し、デルタサブユニットが主なサブユニットであることを報告した。平成9年度は、デルタサブユニットの脳内での機能を明らかにする目的で本酵素の存在部位を検討した。1)デルタサブユニットのみに認められるアミノ酸配列由来のペプチドを合成し、家兎に免疫して抗体を作製した。また、脳より4種類のサブユニットのcDNAを得た。得られたcDNAを発現ベクターに組み込みNG108-15細胞に導入した。それぞれのサブユニットを発現する細胞を用いて、作製した抗体の特異性を免疫ブロット法と免疫染色法により確認した。2)ラット脳の各部位と細胞分画後の免疫ブロットにより、デルタサブユニットが小脳の核分画に多量に存在することが明らかになった。3)共焦点レーザー顕微鏡と電子顕微鏡を用いた免疫組織学的検討によりデルタサブユニットが小脳の顆粒細胞の核内に存在することが明らかになった。4)さらにRT-PCR法により核移行配列をもつデルタアイソフォームのcDNAを小脳から単離することに成功した。5)得られたアイソフォームをNG108-15細胞で発現させ、核内に移行することを共焦点レーザー顕微鏡により確認した。脳由来神経栄養因子(BDNF)は障害神経細胞の再生に関与する可能性があり、小脳の顆粒細胞では細胞内のCa^<2+>濃度の上昇により、その発現が増加することが知られている。今回の結果から、小脳の顆粒細胞でのBDNFの発現にCaMキナーゼIIのデルタサブユニットが関与している可能性が考えられ、今後、NG108-15細胞での発現系を用いて詳細に検討していく予定である。

1996年，我们研究了PC12细胞中的CAM激酶II，并报告了三角洲亚基是主要亚基。 1997年，我们研究了该酶的位置，以阐明三角洲亚基在大脑中的功能。 1）仅在三角洲亚基中发现的氨基酸序列衍生而来的肽是合成的，并将兔子免疫以产生抗体。另外，从大脑获得了四种类型亚基的cDNA。将所得的cDNA掺入表达载体中，并引入NG108-15细胞中。使用表达每个亚基的细胞，通过免疫印迹和免疫染色来证实产生的抗体的特异性。 2）在大鼠脑的每个部分和细胞分馏后的免疫印迹显示小脑核分裂中有大量的三角洲亚基。 3）使用共聚焦激光显微镜和电子显微镜进行免疫组织学研究表明，三角洲亚基存在于小脑颗粒细胞的核中。 4）此外，我们通过RT-PCR成功地分离了Delta同工型的核易位序列。 5）所获得的同工型在NG108-15细胞中表达，并通过共聚焦激光显微镜证实，它迁移到核中。脑衍生的神经营养因子（BDNF）可能参与受损神经元的再生，众所周知，在小脑的颗粒细胞中，由于细胞内Ca^<2+>浓度的增加，其表达增加。基于当前的结果，CAM激酶II的三角洲亚基可能参与小脑颗粒细胞中BDNF的表达，我们计划使用NG108-15细胞中的表达系统进行详细研究。