ヘム置換法による可溶性グアニル酸シクラーゼの活性化機構の解析

点击翻译按钮获取中文摘要

可溶性グアニル酸シクラーゼのヘム鉄をコバルトポルフィリンで置換した再構成酵素(コバルト置換酵素)を調製し、その酵素学的ならびに物理化学的性質を解析し以下の結果を得た。1)酵素の粗抽出液を、pH8.5の条件下で陰イオン交換カラムで処理することにより約90%のヘムを除去することができた。得られたアポ酵素は、嫌気的条件下でヘムならびにコバルトポルフィリンの添加によりそれらの金属を有する再構成酵素を生じた。2)最終的に精製したコバルト酵素のNO(一酸化窒素)存在下での比活性は6μmol/min/mg proteinであった。NO存在下、非存在下の両条件において、コバルト置換酵素は天然型酵素より強いシクラーゼ活性を示した。3)コバルト置換酵素のNO複合体は、399nmにソーレー帯の極大、535,569nmに可視吸収極大を示し、これらの値はコバルト再構成ミオグロビンのNO複合体の極大値とは著しく異なっていた。4)コバルト置換酵素の電子スピン共鳴スペクトルは、コバルト由来の核スピンによる分裂に加えて窒素核に由来する超微細分裂を示した。以上の結果は、第五配位座アミノ酸はヒスチジン残基であり、NOが再構成酵素のコバルト原子に結合するとコバルト-ヒスチジン間の結合が切断され五配位型NO複合体が生じ、その結果シクラーゼ反応部位が活性化されることを明瞭に示している。