中性子結晶構造解析による配位水がリゾチーム立体構造安定性に及ぼす影響の研究

利用中子晶体结构分析研究配位水对溶菌酶空间稳定性的影响

• 批准号: 09261101
• 负责人: 米澤 康滋
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Tsukuba College of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09261101/
• 关键词: 中性子結晶回析; 蛋白結晶化; 蛋白溶解度; 相図; ヒトリゾチーム; 熱安定性; 中性子IP; 酵母発現

ヒトリゾチームの野生型及び各種変異型を中性子結晶構造解析し、構造安定性に及ぼす水分子の影響を解明する事が研究目的である。中性子用IP(イメージングプレート)を装備した中性子回折計(BIX-II)は、既に原子力研究所新村等と協力して建設を完了し、その性能等を評価した。現在ヒトリゾチームの培養と精製を行い、中性子回折用の良質な大型単結晶の結晶化条件の決定と、その作成を遂行中である。各種ヒトリゾチームを酵母の系で発現させ、精製した。この蛋白質で、バッチ法によって蛋白質溶解度の測定と結晶成長を観察し、解析することで結晶化条件決定を行った。バッチ法の実験条件として、温度と沈殿剤濃度及び初期蛋白過飽和度を設定している。温度設定は5度と15度及び25度の3条件、沈殿剤はNaClとした。初期NaCl濃度1wt%から12wt%の条件範囲で、蛋白過飽和度は3wt%から2wt%の間、でそれぞれ実施した。バッチ法によるヒトリゾチーム野生型の、溶解度の計時変化が得られた。野生型は、沈殿剤NaClの場合、過飽和度2.8wt%で温度15度、NaCl濃度3wt%の時 良好な結晶成長を示すことが溶解速度と結晶成長観察から判明した。現在、温度条件とNaCl濃度を調整することでより精密な条件を決定中である。得られた最適条件で、中性子回折実験用の結晶作成を始めている。変異型159Fについて、野生型と同様にバッチ法による溶解度測定と結晶成長観察を行い、結晶化条件を決定した。変異型159Fは、野生型よりも3倍から5倍ほども迅速で良好な結晶成長を、野生型とは大きく異なるNaCl濃度7wt%で、示すことが実験から明らかになった。最近159Fについて、中性子回折に十分な大きさの単結晶(2mm×1mm×0.7mm)を得たので、中性子回折実験で回折パターンを観察し、結晶の質を評価する予定である。変異型159Lと159T、V110Aの溶解度測定も進行中である。

It is a research goal to analyze the neutral crystal structure of the wild type and various variants of the wild type of Ritchidium, explain the structural stability, and explain the influence of water molecules. neutral electron IP equipment (BIX-II), both atomic force research institute and other cooperation, the completion of the construction, the performance of the evaluation At present, the cultivation and purification of rare earths are in progress, and the determination and preparation of crystallization conditions for high-quality large-scale monocrystals for intermediate annealing are in progress. All kinds of yeast are developed and refined. Determination of Protein Solubility and Determination of Crystallization Conditions for Protein Analysis The conditions for the preparation of the method include temperature, solvent concentration and initial protein supersaturation. Temperature setting is 5 ° C, 15 ° C and 25 ° C. The initial NaCl concentration ranges from 1wt% to 12wt% and protein supersaturation ranges from 3wt% to 2wt%. The method of determining the solubility of the wild type and the timing of the solubility of the wild type are described. When the wild type is exposed to NaCl, the supersaturation is 2.8 wt %, the temperature is 15 ℃, and the NaCl concentration is 3 wt %. The crystal growth is good. The dissolution rate and crystal growth are observed. Now, temperature conditions and NaCl concentration are adjusted. Precision conditions are determined. The optimum conditions are obtained, and the crystallization process is initiated. Different types of 159F are used to determine the solubility and crystallization conditions. 159F, wild-type, 3-fold, 5-fold, rapid, good crystal growth, wild-type, large NaCl concentration, 7wt% NaCl concentration Recently, 159F, medium sub-reflection, very large single crystal (2mm×1mm× 0.7 mm) were obtained, medium sub-reflection was observed, and crystal quality was evaluated. The solubility determination of heterotype 159L, 159T and V110A is in progress.