新規電子顕微鏡ラベルを用いた超分子多型の1分子観察と溶液熱力学の確立

使用新的电子显微镜标记对超分子多态性进行单分子观察并建立溶液热力学

• 批准号: 16041245
• 负责人: 永山 国昭
• 金额: $ 8.06万
• 依托单位: National Institutes of Natural Sciences Okazaki Research Facilities
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16041245/
• 关键词: 電子顕微鏡; 構造生物学; 超分子多型; 1分子計測; 溶液熱力学; 蛋白質標識; ラベル; 1分子計測学

多量体蛋白質や蛋白質会合体の超分子多型(サブユニット構造ゆらぎ)について電子顕微鏡による1分子解析法を開発するためシャペロニンGroELを用いて研究を行った。GroELは7量体の環状構造2つが結合することで直径約14nm、高さ約15nmという比較的大きな立体構造を形成する蛋白質であり、蛋白質の多型のモデルとして都合がよい。ラベル剤としてはMonomaleimido Nanogoldを選んだが、これは共有結合により蛋白質のCysに特異的に結合する金クラスター(直径1.4nm)であり、高いコントラストが得られることから電子顕微鏡により観察しやすい利点がある。天然構造状態のGroELは表面に3つのCysを持つ。金クラスターでのラベル化を試みたが、実際にはCysが金クラスターと結合するのに十分なほど蛋白質表面に位置しないことからラベル化されなかった。そこで全てのCysをAlaに置換し、242番のAlaをCysに置換したミュータントGroELを利用することで部位特異的なラベル化を試みた。ラベル化されたGroELをGold Enhanceによるブロッティングと電子顕微鏡観察により解析した。さらにラベル化されたGroELをゲルろ過クロマトグラフィにより未反応の金クラスターから分離精製したところ、GroELの上部に黒いドットとして金クラスターが存在することを電子顕微鏡により観察することができた。現在この方法を用いてADPやATPによるGroELの形態変化と、同一視野を傾斜することにより得られる金クラスター間の距離情報の変化を調べているところである。

Study of supramolecular polymorphism of multi-body protein and protein association by electron microscopy GroEL has a ring structure of 7 molecules, which is about 14nm in diameter and 15nm in height. It has a relatively large three-dimensional structure, which forms a protein structure and a protein polytype structure. Monomaleimido Nanogold is selected from the group consisting of common binding, protein specific binding, gold binding (diameter 1.4 nm), high temperature binding, electron microscopy, electron microscopy, etc. Natural structural state of GroEL and surface 3 The protein surface is located on the surface of the protein. We are also trying to achieve site-specific integration by replacing all Cys with Ala and 242 parts of Ala with Cys and utilizing the unique GroEL. The color of the film is black and white. In addition, the GroEL is separated and refined from the upper part of the GroEL by an electron microscope. Now, this method uses ADP and ATP to change the shape of GroEL, tilt the same field of view, and adjust the distance information between the two fields.

项目成果

膜電位を感じて活性を変化させるイノシトールリン脂質脱リン酸化酵素

通过感应膜电位改变其活性的肌醇磷脂去磷酸酶

• 发表时间: 2006
• 期刊: 蛋白質核酸酵素 51・1
• 作者: Matsuno H;et al.;吉原 良浩;吉原 良浩;M.Sasaki;岡村康司
• 通讯作者: 岡村康司

電位センサーの動作原理と電位感受性酵素VSP

电压传感器和电压敏感酶VSP的工作原理

• 发表时间: 2006
• 期刊: 標準生理学(イオンチャンルの発現制御機構) 25.3月号
• 作者: 津元国親;倉田康孝;古谷和春;倉智嘉久.;川上英良;Mimura K; Nagai Y; Inoue K; Matsumoto J; Suhara T; Nishijo H; Takada M; Minamimoto T;岡村康司
• 通讯作者: 岡村康司

Transfer doublet and an elaborated phase plate holder for 120 kV electron-phase microscope

• DOI: 10.1093/jmicro/dfi049
• 发表时间: 2005-01-01
• 期刊: JOURNAL OF ELECTRON MICROSCOPY
• 作者: Hosokawa, F;Danev, R;Nagayama, K
• 通讯作者: Nagayama, K