枯草菌代謝制御ネットワークの物質産生系への有効活用

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1.前年度までに分岐鎖アミノ酸合成に関わるi1v-1euオペロンのアミノ酸飢餓による正の制御は、GTP低下によるCodYによる負の制御の解除とこのすべロンの転写開始点近傍に存在するcis-配列を介した正の制御である事を明らかにした。後者の制御のcis-配列を特定するため、転写の開始点近傍(-2)TTCA(+2)に塩基置換を導入し、正の緊縮制御への影響を見たところ、(+1)へのGの置換がやや、(+2)のGへの置換が大きく影響し、とくに後者の置換は負の制御にまで転換した。i1v-1euオペロンのin vitroの転写系を組み、RNAポリメラーゼの基質であるGTPとATPの量を変動させrun-off転写産物の量を測定したところ、(+2)のGへの置換がGTPの濃度の低下に極めて感受が高くなる事が判った。pstGの転写開始点の塩基配列は、(-2)TTGG(+2)であり、最初のGが転写開始点で、その次のGをAに変えたときこの負の緊縮制御が見られなくなった。この知見は(+2)のGが負の緊縮制御に関与することを示し、ptsGの負の緊縮制御を回避する方策が見つかった事を意味する。さらに負の制御を受けるpdhオペロンと正の制御を受けるpycA遺伝子の転写の開始点は、それぞれ、(-2)ATGT(+2)と(-2)TTAT(+2)であり、(+1)のGとAが負と正の制御関連していることが強く示唆された。これらの知見は転写開始点あるいはその次の塩基がGかAで、緊縮制御が正の制御か負の制御かが決定される事が推察された。従って、緊縮制御をうけるプロモータでは、RNAポリメラーゼによる転写開始の頻度が、基質のGTPとATP特にGTPの溝度に強く依存すると推定された。2.野生株とcosY変異株を用いたメタボローム解析により、codY変異が分岐鎖アミノ酸合成を上昇させるという事がわかった。また、リジン欠乏で緊縮制御をかけた場合も分岐鎖アミノ酸合成が高まった。しかし、イソロイシンの前駆体であるスレオニン合成に関わるhom-thrC-thrBオペロンは、正の緊縮制御を受け、さらにリジン欠乏そのもので誘導される事が判明した。