生体内蛍光イメージングによる虚血性神経細胞死に果たすグリアの役割の検討

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【目的・方法】海馬CA1領域の虚血に対する脆弱性の原因をニューロン・グリアの相互連関に求め、生体内イメージング法により虚血時のグルタミン酸を介したシグナル伝達を検討することを目的とした。ラット(体重300g)にてイメージングに適する4血管閉塞モデルを作成。fluo-3/AMを海馬CA1およびCA3領域にpressurized bolus injectionしファイバー共焦点顕微鏡(Imaging Fiberを20,000本束ねて共焦点スキャナとカップルさせ脳深部の共焦点縁観察を可能にした)で蛍光像を観察、一過性(10分間)前脳虚血時の脳内カルシウム反応を海馬CA1領域とCA3領域で比較検討した。【結果】生体内蛍光イメージングでは、励起光・蛍光共に吸収するヘモグロビン量の低下により、虚血そのものが蛍光強度を上昇させるので、蛍光ビーズを用いてその補正を行った(前年度成果)。CA1とCA3領域の脳血流は4血管閉塞による変化に差はないにも関わらず、虚血に対して脆弱な海馬CA1領域ではCA3領域とは異なった細胞内Ca^<2+>濃度の持続的上昇が観察できた。さらに、グリアの関与を明らかにするために、GliotoxinであるL-a-aminoadipic acid(L-aAAA、20mM、10μl)を海馬にmicroinjectionし、24時間後に虚血時のカルシウム反応を検討した。Gliotoxinにより海馬CA3領域のGFAP陽性細胞の数は減少し、CA3領域でもCA1と似た細胞内Ca^<2+>濃度の持続的上昇傾向を示した。【まとめ】CA3にGliotoxinを投与しグリアに損傷を加えると、CA3のカルシウム反応はCA1のそれに似る傾向にあった。これはCA3の虚血抵抗性(CA1の脆弱性)にグリアが関与している可能性を示唆しているかもしれない。今後さらに継続して、カルシウム反応だけではなく細胞死とグリアに機能の関係を検討する必要がある。また、GFAP陽性細胞に選択的にCameleon(Ca^<2+>濃度指示性の蛍光蛋白)が発現するようベクターの組み替えを行い、electroporation法によりadultratにおいて、脳内の任意の部位にin SituでCameleonを発現させることが可能になったが、これを用いた観察は明るさが不足していて実現せず、虚血時におけるグリア細胞のカルシウム反応を検討するための課題を残している。