無細胞蛋白質合成技術を応用した植物膜輸送タンパク質の機能解析

利用无细胞蛋白质合成技术进行植物膜转运蛋白的功能分析

基本信息

批准号：
18056016
负责人：
戸澤譲
金额：
$ 3.33万
依托单位：
Ehime University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18056016/
关键词：
膜蛋白質膜輸送無細胞翻訳系リポソーム膜タンパク質

项目摘要

平成19年度には、18年度に確立した無細胞蛋白質合成技術を応用したプロテオリポソーム再構成系を用いて、ホスホエノールピルビン酸(PEP)の葉緑体内膜輸送を司るトランスポーターArabidopsis PPT1ならびにTPT(triosephosphate transporter)をコントロールとして、イネのPPT1ホモログ3種類(OsPPT1,OsPPT2,OsPPT3)の輸送基質特異性を明らかにした。イネPPT蛋白質は予想した通りPEPをリン酸対向輸送の主な基質とするトランスポーターであり、PPT1およびTPTの輸送活性が、基質特異性、比活性ともに、酵母を利用した組換え蛋白質の再構成実験より報告されている数値と同等であることを明らかにした。以上より、本課題で確立した無細胞蛋白質合成技術が膜蛋白質の機能解析に有効であることを確認した。平行して、再構成膜輸送蛋白質を精製する技術として一般的なスクロース密度勾配法に加えて、アキュデンツ(accudenz)を用いた密度勾配超遠心分離法による分画法を無細胞膜蛋白質合成系に導入した。アキュデンツ密度勾配系では、下層に分画すべきリポソームサンプル層を形成させ、超遠心分離操作中に下層から最上層ヘリポソーム画分を移動させ、可溶性タンパク質は最下層に残すことが可能となる。可溶性のGFP(green flourescent protein)が最下層に留まるのに対し、PPT1はリポソームと共に最上層へ移動していることが確認され、この系がプロテリオリポソーム分離精製法として有効であることを確認した。

2007年，使用2006年建立的无细胞蛋白质合成技术使用蛋白质脂体的重构系统，使用拟南芥PPT1和TPT（Triosephate Transporter）的三个水稻PPT1同源物（OSPPT1，OSPPT2，OSPPT3）的运输底物特异性（OSPPT1，OSPPT2，OSPPT3），该转运量的运输量，PPPT 1控件已澄清。正如预期的那样，水稻PPT蛋白是一种使用PEP作为磷酸盐相反转运的主要底物的转运蛋白，并且发现PPT1和TPT1和TPT的转运活性与使用酵母重组蛋白重组重组重组重组实验中报道的值可比。从以上，已经证实，该学科中建立的无细胞蛋白质合成技术对膜蛋白的功能分析有效。同时，除了纯化重组的膜转运蛋白的常见技术外，还将使用ACCUDENZ的密度梯度超速离心进行分馏，这是一种常见的技术。在Accudentz密度梯度系统中，在下层中形成要分馏的脂质体样品层，并且在超速离心的操作过程中，最高的螺旋体分数可以从下层移动，从而使可溶性蛋白质处于最低层。已经证实，可溶性GFP（绿色荧光蛋白）保持底层，而PPT1与脂质体一起迁移到顶层，并且该系统作为一种蛋白质脂质体的分离和纯化方法有效。