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ATP合成酵素の全体構造解析を突破口とした分子機構の解明

以ATP合酶整体结构分析为突破口阐明分子机制

基本信息

批准号：
19042006
负责人：
三留規誉
金额：
$ 4.1万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19042006/
关键词：
ATP合成酵素構造解析分子モーター

项目摘要

結晶化のためには、適切な界面活性剤を用いて分子を単分散に可溶化することが必要である。また、ATP合成酵素の場合、単分散性の問題の他に、界面活性剤がサブユニットの解離を促すという問題がある。本年度では、ATP合成酵素の結晶化に適した界面活性剤を検討した。検討に用いた界面活性剤は、膜蛋白質の構造解析で複数の成功例が報告されている界面活性剤を選択した。マルトシド系7種、グルコシド系2種、スクロース系1種(sucrose monodecanoate)、アルキルオキシエチレン6種、アルキルジメチルアミンオキサイド1種(LDAO)、その他2種の合計19種類を用いた。大腸菌内で好熱菌Bacillus PS3のATP合成酵素を発現させ、その膜画分を調製した。膜画分からATP合成酵素を各種界面活性剤で可溶化し、それを超遠心した後の上清から、Ni-NTAクロマトグラフィーによりβサブユニットのHis-tagを介してATP合成酵素を精製した。可溶化率と精製効率および得られた複合体の安定性を検討するため、超遠心後の上清と沈殿およびNi-NTAクロマトグラフィーの素通りと溶出画分をSDS-PAGEにより分析した。複合体の単分散性を調べるため、精製して得られたATP合成酵素を界面活性剤存在下のゲルクロマトグラフィーで分析した。Ni-NTA精製で得られたATP合成酵素が機能を保持していることを確かめるために、それらのATP合成酵素をリボソームに再構成し、ATPase活性およびそのDCCD阻害、ATP駆動のプロトン輸送活性を分析した。その結果、ドデシルマルトシドなどのマルトシド系の界面活性剤とsucrose monodecanoateでATP合成酵素は高い可溶化率で機能を保持した安定な複合体を単分散した状態で得ることができることがわかった。これらの界面活性剤を用いて、ATP合成酵素やその変異体の結晶化を行っている。

Crystallization is necessary for proper interfacial activity and molecular dispersion. In addition to ATP synthase, the problem of dispersion, the problem of interfacial activity and dissociation This year, the crystallization of ATP synthase was investigated. A number of successful examples for the structural analysis of membrane proteins using surfactant are reported. There are 7 kinds of species, 2 kinds of species, 1 kind of species (sucrose monodecanoate), 6 kinds of species, 1 kind of species (LDAO), and 2 kinds of species. The ATP synthase of Bacillus PS3 in Escherichia coli is produced and its membrane composition is modulated. ATP synthase solubilized by various interfacial active agents, and purified by His-tag from Ni-NTA. Solubility, purification and stability of the complex were analyzed by SDS-PAGE. The dispersion of the complex is regulated, purified and analyzed in the presence of ATP synthase and surfactant. Ni-NTA purification results in ATP synthase function maintenance, ATPase activity, DCCD inhibition, ATP transport activity analysis. As a result, the interfacial activity of ATP synthase and sucrose monodecanoate is maintained in a stable state. The interface activity of ATP synthase and the crystallization of different enzymes were studied.