H.halobiumのΔμ^^〜H^+駆動Na^+ポンプ

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H.halobiumのNa^+/H^+交換輸送系は、DCCD感受性であり、膜電位(ΔΨ)でゲートされる二次的Na+-ポンプとしての性格を持つことが明らかになってきたが、その活性制御機構の詳細を知ることは、ΔμH^+と二次的輸送系の共役機作の解明のために重要である。本年度は本Na^+-ポンプのΔpH、ΔΨによる制御機構を更に解析し、蛋白化学的性質解明のためのDCCDS結合蛋白の単離、機能的再構成についても検討を加えた。本輸送系の作動によるΔpHの減少がΔΨの増加を伴う事から、Na^+/H^+比は1以上であるとの議論があったが、膜小胞に於ける光依存的なΔpH、ΔΨ変化挙動をNa^+/H^+の1:1交換体であるモネンシンと比較して、1:1でも高Na^+-濃度下では効率的なΔpH→ΔΨ変換の起こることを証明した(Biochimie.'88 70 819)。ΔμH^+依存的なNa^+-排出に対するΔpH、ΔΨの役割を解析し、Na^+-排出がΔμH^+と共役するためには膜外側にあるH^+解離基(pKa=4.6)のH^+化が必須であること、膜内側にあるもう一つのH^+解離基のpKaがΔpHはよってアルカリシフトすることがΔpHによるNa^+-排出駆動の本質であることを明らかにした(Arch.Biochem.Biophy-s..'89印刷中)。Na^+結合部位の性質がΔpH、ΔΨでどの様に変化するかを検討し、一定ΔΨ存在下、ΔpHはNa^+に対するKmを減少させ、Vmを増加させるのに対して、ΔΨは一定ΔpHは存在下Kmを変化させる事なくVmを増加させた。また約100mVのゲート電位前後ではKmに大きな差があることから、ΔΨにより交換輸送体の構造が大きく変化することが予想された。また、膜の外側にはKd<50uMのNa^+結合部位が存在し、そこへのNa^+の結合が輸送体活性化に必須であることも明らかにした(投稿準備中)。一方DCCD結合蛋白の単離に関しては、再現性、収率の点で、再構成についても再現性の点で問題を残しており、引き続いて検討を加えている。