大腸菌遺伝子欠失株ライブラリを用いた薬剤耐性獲得抑止ターゲットの網羅的探索

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令和4年度は、前年度に引き続きラボラトリーオートメーションシステムを利用した薬剤持続性検出系の検討、及び前年度に得られた候補株の遺伝子欠失株と網羅的遺伝子欠失株ライブラリとを組み合わせた二重欠失株の構築を進めた。384ウェルプレートでの並列薬剤実験系の構築において前年度に検出が困難であった持続生残菌について、高持続性の観察できるタイミングや菌液の濃度を検討し、適切なスクリーニングの条件を得た。具体的には、昨年度に得られた薬剤持続性候補株を用いた場合、薬剤処理時間5～10時間において野生株との差が最も大きくなることが明らかになったことにより、薬剤処理開始から植え継ぎまでの時間を7時間前後にすることで384 ウェルプレートでの持続性株のラフスクリーニング及び高持続性の検出が可能となった。また、前年度に得られた候補株について、接合伝達によって遺伝子欠失領域を他の株に移行できるHfr(High frequency recombination)株を構築した。このHfr株を用い、大腸菌網羅的一遺伝子欠失株ライブラリKeio collectionに含まれる4,000株に対して二重欠失株の構築を行うため、384 ウェルプレートを用いた二重欠失株構築系の検討を行なった。既存のプロトコルでは2mlの系で行う接合伝達工程を、384ウェルプレートで1ウェルに入れることのできる80μl以下で行うための条件検討を行った。