Development of In-Depth Top-Down Proteomics Method for Comprehensive Analysis of Human Proteoforms

点击翻译按钮获取中文摘要

本課題ではクリスティアン・アルブレヒト大学キール（CAU）のトップダウンプロテオミクス研究グループ（代表：Prof. Andreas Tholey）との国際共同研究により、質量分析による高深度なインタクトプロテオフォーム解析を可能にする新規トップダウンプロテオミクス法の開発を行う。今年度は、ポリアクリルアミドゲル内のインタクトタンパク質の高効率受動抽出法（PEPPI-MS）を活用したゲルベースのプロテオーム分画、C4カラムを用いた逆相液体クロマトグラフィによる追加分離、そしてフィールド非対称イオン移動度分光分析法（FAIMS）による気相中でのタンパク質イオン分離を組み合わせた多次元プロテオームサンプル分離技術（GeLC-FAIMS）の開発に成功しており、現在までにCAUが保有する高分解能Orbitrap質量分析装置とGeLC-FAIMSを組み合わせることにより、高深度トップダウンプロテオフォーム解析のための計測システムを構築することに成功している。また現状のトップダウンプロテオミクスワークフローでは解析が困難な50 kDa以上の高分子量プロテオフォームを計測するための新たな手法として、Glu-Cプロテアーゼによる限定消化処理とGeLC-FAIMSを組みわせた高深度ミドルダウンプロテオフォーム解析用のサンプル前処理ワークフロー開発に取り組み、開発したワークフローの性能評価をTholey研究室において実施した（2023年3月に研究代表が訪問）。市販のヒト培養細胞抽出物を用いた解析の結果、PEPPI-MSによる分画処理を行うことにより検出可能なGlu-C消化断片数が2.3倍増加することが明らかとなった。現在は開発ワークフローを用いて、ヒト乳がん細胞株（4175細胞）由来エクソソームサンプルのプロテオフォーム解析を進めている。