The Activator (Ac) element from maize: transposition mechanism and regulation and advancement as a mutagenesis tool

玉米激活剂 (Ac) 元件:转座机制以及作为诱变工具的调控和进步

基本信息

项目摘要

The Activator/Dissociation (Ac/Ds) transposable elements from maize are extensively used as mutagenesis and gene isolation tools in many plant species. However, the transposition frequencies vary widely and in some species they are too low for large scale gene tagging approaches. This project aims to elucidate the still poorly understood regulation and transposition mechanism of Ac/Ds, to improve its controllability and to extend the applicability of Ac/Ds as mutagenesis tool in vertebrate cells. (1) We previously demonstrated that the concentration-dependent transposase (TPase) assembly into either active oligomers or non-productive aggregates plays a critical role in regulating Ac/Ds transpositon. To better understand these processes we want to identify the TPase catalytic site and protein interaction domains. (2) In preliminary experiments with Ac in yeast we identified TPase mutants with increased activity. We want to investigate the biochemical mechanism of hyperactivity and generate TPase mutants with even higher activity. (3) In earlier experiments TPase activity was estimated by using transient excision assays in plant protoplasts. To more reliably determine the excision and forward mutagenesis activity, novel assays in transgenic plants will be established. (4) We will investigate the suitability of Ac/Ds for insertion mutagenesis in human cells.
来自玉米的激活/解离(Ac/Ds)转座因子被广泛用作许多植物物种的诱变和基因分离工具。然而,转座频率变化很大,在一些物种中,它们对于大规模基因标记方法来说太低。本项目旨在阐明Ac/Ds的调控和转座机制,提高其可控性,并扩大Ac/Ds作为脊椎动物细胞诱变工具的适用性。(1)我们以前证明,浓度依赖性转座酶(THEB)组装成活性寡聚体或非生产性聚集体在调节Ac/Ds转座中起着关键作用。为了更好地理解这些过程,我们希望确定Tribunal催化位点和蛋白质相互作用结构域。(2)在用Ac在酵母中进行的初步实验中,我们鉴定了具有增加的活性的Tclase突变体。我们希望研究多动的生化机制,并产生具有更高活性的TcR突变体。(3)在早期的实验中,通过在植物原生质体中使用瞬时切除测定来估计Tclase活性。为了更可靠地确定切除和正向诱变活性,将建立转基因植物中的新测定法。(4)我们将研究Ac/Ds在人细胞中插入诱变的适用性。

项目成果

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