次世代型標的遺伝子破壊法CRISPR/Cas9システムの歯学領域への応用

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本研究の目的は、歯の形成不全の発生機序の解明のために、次世代ノックアウト（KO）技法を用い、乳歯髄細胞内の標的遺伝子を効率的に破壊し、歯構成細胞への分化誘導後の細胞の機能を検討することである。そこで、まずは次世代型KO技法である、CRIPR/Cas9システムの動作確認のために、α-1, 3-GalactosyltransferaaseをKOしたブタ胎児線維芽細胞を作製したところ、薬物耐性を有するKO細胞株の樹立が可能であった。また、pCGsap1/DSPP, pTrans, pT-EGFP, pT-Hyg発現ベクターを作製し、乳歯歯髄細胞へ遺伝子導入を行ったところ、20％程度の遺伝子導入株を確認することができた。さらに、Cas9とdentin sialophosphoprotein(Dspp)遺伝子を標的としたguide RNAを同時に発現するベクターと、Hygromycin B耐性遺伝子発現ベクターと、EGFP蛍光遺伝子発現ベクターを、electroporation systemを用いて、歯髄細胞に共遺伝子導入した。１回目の実験では、遺伝子導入後の細胞をHygromycin Bでセレクションした後、濃縮株についてゲノム解析を行ったが、Dspp遺伝子に変異は認められなかった。続いて２回目の実験を行い、CRISPR/Cas9システムによる標的遺伝子上の変異誘導効果について検討した。