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正確な染色体分配を保証する新たな中心体ポジショニング機構の解明

阐明确保染色体精确分离的新中心体定位机制

基本信息

批准号：
22KJ1178
负责人：
小森琢磨
金额：
$ 1.6万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ1178/
关键词：
中心体細胞分裂

项目摘要

中心体は動物細胞小器官の一つであり、細胞分裂における紡錘体の極として機能する。これまで様々ながん細胞株を対象とした解析から、分離した2つの中心体は、核の下から核を挟むように側面へと移動して核膜崩壊を迎えると考えられてきた。その一方で、正常細胞株では、核膜崩壊時にそれぞれの中心体が核の上下に配置されることも示されている。しかし、この中心体の特徴的な配置の分子機構やその意義は全くの未解明である。本研究では、この特徴的な核膜崩壊時の中心体配置の分子機構を明らかにすることを目的とした。当該年度は以下の実験を行った。1.核膜崩壊直前の特徴的な中心体配置を決定する因子の同定：複数の中心体関連因子対象とした小規模siRNAスクリーニングを実施し、この現象における主要因子の同定に取り組んだ。ここではZ軸解像度の高い顕微鏡を用いてそれぞれの処理群に対する正確な評価を行った。その結果、複数の因子において中心体の特徴的な配置が減少することが確認された。2.候補因子のノックアウト細胞株の樹立：得られた候補因子に対し、自身が最適化した手法であるCRISPR-del法を用いてノックアウト細胞株を樹立した。これは標的遺伝子の上流・下流をターゲットとする二種類のsgRNAを同時に導入することで標的遺伝子の全長を欠損させる方法である。これにより、”完全なノックアウト細胞株”の作成に成功し、候補因子の欠損による表現系がsiRNAのオフターゲットである可能性が排除された。3.ライブセルイメージング系の確立：上記の細胞株に対して中心体と核に蛍光タンパク質を発現する細胞株を作成し、ライブセルイメージングによる解析を行った。これによりノックアウト細胞株中での実際の中心体動態や細胞周期全体に対する影響を詳細に解析することが可能になった。

The centrosome is an important part of the small organ of animal cells and the extreme function of the spindle during cell division. The cell line is isolated from the centrosome and the nucleus is moved from the bottom to the nucleus. In normal cell lines, nuclear membrane collapse occurs when the centrosome is positioned above and below the nucleus. The molecular structure of the centrosome features is not fully understood. This study aims to clarify the molecular mechanism of centrosome configuration during nuclear membrane collapse. When the year is over 1. Identification of factors determining centrosome disposition prior to nuclear membrane collapse: identification of multiple centrosome-related factors for small-scale siRNA deployment, identification of major factors for this phenomenon This is a high resolution micro-mirror for Z axis resolution. The result is that the configuration of the centrosome features in the complex factors is reduced. 2. Establishment of candidate factors and cell lines: the CRISPR-del method was used to establish candidate factors and cell lines optimized by themselves. The method of introducing two kinds of sgRNA simultaneously into the upstream and downstream of the target gene is described. The possibility that the expression system of siRNA was successfully constructed and the candidate factors were damaged was excluded. 3. Establishment of cell lines: analysis of cell lines for centrosome and nuclear development The effect of centrosome dynamics and cell cycle on cell lines was analyzed in detail.