DNAカーテン上の複製フォーク超複合体の一分子観察

DNA帘上复制叉超复合物的单分子观察

• 批准号: 22KJ1763
• 负责人: 寺川 まゆ
• 金额: $ 3.08万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ1763/
• 关键词: DNA複製; 再構成; 一分子観察

DNA複製は生命にとって非常に重要なイベントの一つとして知られている。DNAが複製されるためには、最低でも約20種類におよぶタンパク質が各段階に応じて集まり、協同して働く必要があることが知られている。これまでに、分子生物学的な手法を用いて、数々のDNA複製関連タンパク質が同定され、その機能の一端が明らかにされてきた。しかし、これまでの分子生物学研究においては雑多な分子も多く含む細胞の抽出液が用いられてきたことから、DNA複製の詳細な分子メカニズムはあまりよく分かっていない。本研究では、再構成系の実験系を用いて、DNA複製反応を一分子観察することにより、生物物理学的視点でDNA複製反応を観察し、分子機構を明らかにしていこうとしている。昨年度は、DNA複製に最低限必要なタンパク質の精製を終え、また精製したタンパク質のDNAへの結合能やunwinding能を調べた。今年度は、DNAカーテンをつくる技術を身に着け、精製したタンパク質の一部を用いて、タンパク質のDNAへの結合を一分子観察することを目指した。まず、DNAカーテンの作成のために、スライドガラスへの表面加工方法や、スライドガラスへの電子線を用いたパターン描写テクニックを身に着けた。DNAカーテン法ではλDNAを用いるため、ファージの培養やλDNAの精製方法なども学んだ。精製したλDNAを組み立てたDNAカーテン用のチャンバーに添加し、DNAカーテンを作成することに成功した。そこに、精製したORC,Cdc6,MCM2-7,Cdt1を添加し、複製開始前複合体と呼ばれるDNA複製の初期段階に見られる複合体をDNAに結合したものを観察することができた。

DNA replication は life に と っ て very important な に イ ベ ン ト の a つ と し て know ら れ て い る. が DNA replication さ れ る た め に は, minimum で も about 20 kinds に お よ ぶ タ ン パ ク qualitative が paragraphs order に 応 じ て set ま り, collaborative し て 働 く necessary が あ る こ と が know ら れ て い る. こ れ ま で に, molecular biology な gimmick を with い て, several 々 の DNA replication masato even タ ン パ ク qualitative が be さ れ, そ の function の end が Ming ら か に さ れ て き た. し か し, こ れ ま で の molecular biology に お い て は 雑 more な molecular も く cells contain む の extract が with い ら れ て き た こ と か ら detailed な molecules, DNA replication の メ カ ニ ズ ム は あ ま り よ く points か っ て い な い. This study で は tied to constitute の be を 験 department with い て, DNA replication 応 を a molecular 観 examine す る こ と に よ り, biophysics of viewpoints で DNA replication anti 応 を 観 examine し, molecular institutions を Ming ら か に し て い こ う と し て い る. Yesterday annual は, DNA replication に minimum standard necessary な タ ン パ ク の refined を eventually え, ま た refined し た タ ン パ ク qualitative の DNA へ の binding energy や unwinding to を べ た. Our は, DNA カ ー テ ン を つ く る technology を around に け, refined し た タ ン パ ク qualitative の a を with い て, タ ン パ ク qualitative の DNA へ の is combined with a を molecular 観 examine す る こ と を refers し た. ま ず, DNA カ ー テ ン の made の た め に, ス ラ イ ド ガ ラ ス へ の や surface machining method, ス ラ イ ド ガ ラ ス へ の electronic line を い た パ タ ー ン describing テ ク ニ ッ ク を around に け た. Method of DNA カ ー テ ン で は lambda DNA を with い る た め, フ ァ ー ジ の train や lambda DNA の refined methods な ど も learn ん だ. Refined し た lambda DNA み を group set て た DNA カ ー テ ン with の チ ャ ン バ ー に add し, DNA カ ー テ ン を made す る こ と に successful し た. そ こ に, refined し た ORC, Cdc6, MCM2-7, Cdt1 を add し, copy prior to the start of the complex と shout ば れ る DNA replication の early Duan Jie に see ら れ る complex を DNA に combining し た も の を 観 examine す る こ と が で き た.

项目成果

Evaluation of DNA binding of yeast replisome toward single-molecule observation of DNA replication

评估酵母复制体的 DNA 结合对 DNA 复制的单分子观察

• 发表时间: 2021
• 作者: Mayu S. Terakawa;Tsuyoshi Terakawa
• 通讯作者: Tsuyoshi Terakawa

Single molecule imaging of DNA unwinding by budding yeast MCM2-7

芽殖酵母 MCM2-7 解旋 DNA 的单分子成像

• 发表时间: 2022
• 作者: Terakawa MS;Terakawa T
• 通讯作者: Terakawa T