Development of FRET system for screening of PAD-specific inhibitors from periodontopathogenic bacteria.

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歯周病原細菌であるPhorphylomonas gingivalis（P. g）が関節リウマチ（RA）の発症に関与する可能性が報告されているが、分子生物学的な根拠は不十分である。RAの発症の原因の一つとして宿主由来のシトルリン化酵素（PAD）が考えられているが、P. gは口腔内細菌で唯一PAD （PPAD）を産生することが報告された。しかしながら、PPADが宿主タンパクをシトルリン化し、抗CCP抗体を誘導することを証明した報告は、未だない。我々は、P. gのRA発症への分子生物学的な因果関係を明らかにすることを研究目的とした。実験にはRAW264.7マクロファージ様細胞（RAW細胞）を用い、P. gはW83株を全菌体もしくは外膜小胞を分離して細胞障害性を確認し使用した。PPADに特異的な配列のペプチドを合成し、PPAD阻害剤の候補としてPPADに対するモノクローナル抗体を作製した。作製した抗PPAD抗体を用いてその親和性と特異性を検討した。作製した抗体は歯周病原細菌のうち、P. gの全菌体または外膜小胞を特異的に認識することが確認された。P. gを感染させたRAW細胞とその培養上清を用いてビメンチンのシトルリン化の検出を検討した結果、培養上清のシトルリン化を確認した。また同様に検出されたビメンチンがシトルリン化されていると想定した。PPADの機能をさらに明らかにするためにPPAD欠損株を用いて増殖能・炎症性サイトカインの産生・貪食能についても検討した。PPADの欠損によりP. g自体の増殖能が向上したが、感染させたRAW細胞の増殖能には影響を与えなかった。P. gで刺激したRAW細胞の培養上清を用いてTNF-αの産生を調べた結果、P. g菌の全菌体よりも外膜小胞による刺激の方がRAW細胞のTNF-α産生を誘導したが、PPADの欠損や抗体による中和はそれに影響を与えなかった。