大麦の根に存在する二種の硝酸還元酵素の分離精製と細胞内局在性

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研究計画に基づき、大麦幼植物の根に存在する2種の硝酸還元酵素、すなわちNADH要求性酵素とNAD(P)H要求性酵素をブルーセファローズに吸着させ、0.1mMNADPHで、次いでNADHで溶出するとそれぞれNAD(P)H酵素とNADH酵素が分離された。本研究の特色であるNAD(P)H酵素をさらにブルーセファローズによる再クロマトにかけ、NADPHによるグラジエント溶出を行い、高比活性(2.56ユニット/mgタンパク質)のNAD(P)H酵素を得た。この酵素はNADPHをNADHより有効に利用し、活性比は1.2であり、この酵素反応ではNADPH酸化量と等量の亜硝酸とNADP^+が生成し、NO^-_3に対するKm値は0.19mM、至適phは7.5であり、これまで得られている同種の酵素と類似していた。大麦の葉にはNAD(P)H酵素が検出されず、NADH酵素のみが存在した。葉のNADH酵素と根のNADH酵素には免疫学的に識別出来なかったが、根のNAD(P)H酵素とは異なると推察された。根に存在する2種の酵素の細胞内局在性を調べるため、まずトリトン×100の添加がNADH酵素よりもNAD(P)H酵素の可溶化を促進することからNAD(P)H酵素は膜に結合している可能性が示唆された。そこで購入したスイングロータを用いて水性2層分配法により原形質膜画分を調整し、NADPH活性を調べたが、活性が極めて小さく、操作途上で失活した。現在失活防止条件を詳細に検討しているところであるが、スイングロータを活用して原形質膜にNAD(P)H酵素が存在することを確認したいと考えている。NAD(P)H酵素は培地にNO^-_3が存在しなくても検出され、また根軸に沿った分布ではほぼ均等に分布した。これは、NADH酵素と著しく異なり、NAD(P)H酵素はNADH酵素とは別の機能を担っている可能性を示唆しており、それが原形質膜に存在すれば大変興味深い。