鉄酸化細菌の鉄酸化酵素遺伝子のクロ-ニングと鉄酸化細菌への導入

1.標記酵素は鉄酸化細菌Fe1株よりSDSーPAGE的に均一に精製され、N末端のアミノ酸配列が決定されている。東工大山中教授からの私信に基ずき、18merと21merの2種のオリゴヌクレオチドを化学合成しプロ-ブとして用いた。2.Fe1株の染色体DNAを調整し、EcoRI,PstIのプラスミドライブラリ-を構築した。これらのライブラリ-より1で述べたプロ-ブを用いて4c22塩基対からなるEcoRI断片として目的クロ-ンを単離した。3.塩基配列決定の結果、目的遺伝子は255塩基対の短い読み枠を有していた。84ケのアミノ酸配列のうち31ケはシグナル配列を形成し、成熟酵素のサブユニット部分はわずか53ケのアミノ酸よりなっていた。これは、精製酵素サブユニットの分子量が8,000以下である事とも一致した結果である。4.現在、大腸菌用発現ベクタ-にのせて大腸菌での本酵素の発現を試みている。5.得られた4Kbの断片上には目的遺伝子の他に1290塩基対よりなるプリン生合成に関与するpurA遺伝子も存在している事が判明している。6.鉄酸化細菌の宿主ベクタ-系構築に必要な選択マ-カ-遺伝子として、Eー15株由来の水銀耐性遺伝子を単離し、遺伝子構成を明らかにした。現在、この遺伝子を用いてシャトルベクタ-の構築、導入を試みている。

1.標記酵素は鉄酸化細菌Fe1株よりSDSーPAGE的に均一に精製され、N末端のアミノ酸配列が決定されている。東工大山中教授からの私信に基ずき、18merと21merの2種のオリゴヌクレオチドを化学合成しプロ-ブとして用いた。2.Fe1株の染色体DNAを調整し、EcoRI,PstIのプラスミドライブラリ-を構築した。これらのライブラリ-より1で述べたプロ-ブを用いて4c22塩基対からなるEcoRI断片として目的クロ-ンを単離した。3.塩基配列決定の結果、目的遺伝子は255塩基対の短い読み枠を有していた。84ケのアミノ酸配列のうち31ケはシグナル配列を形成し、成熟酵素のサブユニット部分はわずか53ケのアミノ酸よりなっていた。これは、精製酵素サブユニットの分子量が8,000以下である事とも一致した結果である。4.現在、大腸菌用発現ベクタ-にのせて大腸菌での本酵素の発現を試みている。5.得られた4Kbの断片上には目的遺伝子の他に1290塩基対よりなるプリン生合成に関与するpurA遺伝子も存在している事が判明している。6.鉄酸化細菌の宿主ベクタ-系構築に必要な選択マ-カ-遺伝子として、Eー15株由来の水銀耐性遺伝子を単離し、遺伝子構成を明らかにした。現在、この遺伝子を用いてシャトルベクタ-の構築、導入を試みている。