Clostridium difficileの毒性産生機構に関する研究

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有毒Clostridium difficile3株(KZ1604、1630、1660)を用いて胞子形成とサイトトキシン(CT)産生の関係を経時的に検討した。対数増殖期に同調した各菌液を10^6倍希釈した後、その0.2mlを10mlの0.2%Na_2PO_4加BHI培地に植菌した(接種菌数:栄養型細胞数、2.6〜4.8×10^1;胞子数、0)。全菌株とも植菌18時間後に総菌数(栄養型細胞数+胞子数)は最高値に達した(3.1〜3.8×10^8/ml) 。一方胞子は18時間後より検出され経時的に増加し、42〜48時間後にプラトーに達した(6.2×10^5〜8.2×10^6/ml)。細胞内CTは胞子形成時期と同時期(培養18時間)より出現し、胞子数の増加と共に増加し、胞子数がプラトーに達する6〜12時間前に最高値に達した(64〜512CU/50μl)。細胞外CTの検出は植菌後24時間よりみられ植菌48時間後に最高値に達した(64〜4096CU/50μl)。これらの結果より、CT産生が胞子形成とほぼ同時期に行われることが明らかとなった。胞子形成とCT産生の関係を更に確かめるため、胞子形成阻害剤アクリジンオレンジ(AO)、プロメサジン(PM)を用いた実験を強毒株KZ1630を用い行った。植菌12時間後にAOを培地に加え(30μg/ml)培養を続けた。AO添加培養における総菌数は対照と差異は認めなかったが、胞子数は植菌48時間後において1.1×10^2/mlにすぎず対照(5.2×10^6/ml)に較べ著明に低下していた。AO添加培養における細胞内CT値は対照の1/4〜1/8にすぎなかった。細胞外CT値はAO添加培養では顕著に減少し植菌36、48、60、72時間後の値は各々8、32 、128、128CU/50μlにすぎなかった(対照:1024、4096、4096、4096CU/50μl)。PM添加培養でも同様の傾向が認められた。これらの結果より胞子形成がCT産生に密接に関与している事が示唆された。光顕的に胞子は認められないがCTを産生する菌株について電顕的観察を行った。これらの菌株では電顕的にも胞子形成過程は認められず、胞子無形成菌におけるCT産生機序は胞子形成菌のそれとは異なる事が示唆された。