脊椎動物の視細胞外節のcGMPに依存したカチオンチャンネルの解明

脊椎动物感光器外节中 cGMP 依赖性阳离子通道的阐明

• 批准号: 63580207
• 负责人: 篠沢 隆雄
• 金额: $ 0.83万
• 依托单位: Gunma University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1988
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1988 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-63580207/
• 关键词: 視細胞; 桿体視細胞外節; サイクリックGMP結合蛋白質; Naイオンチャンネル; 視興奮

脊椎動物の視細胞外節(Rod Outer Segments ROS)のNa(カチオン)チャンネル蛋白質としてはCookらの分子量63K(我々の66K)と我々の報告している分子量250Kの二種の蛋白質が存在すると考えられる(篠沢他:生物物理28、152-155、1988)。本研究は250K蛋白質の解析に焦点をしぼり、以下の進展を得た。250K蛋白質の精製:カエル視細胞外節(ROS)を蔗糖浮上法で調製し、CHAPSを用いて可溶化後、5-20%蔗糖密度勾配遠心法で分画した。SDS PAGEで250K蛋白質画分を確認し、cAMPアガロース(cGMPアガロースは市販されていない)に吸着後、EDTA、KClによる脱着により250K蛋白質画分を得た。これらの方法による最高純度は約50%だが、操作条件の改善により有望である事が判った。チャンネル活性の検出:部分精製した250K蛋白質画分をリポソームに組込みCookらの方法によるチャンネル活性の検出に成功した(生物物理、28、S209、1988)。リポソームの安定化と純品の250K蛋白質での実験が今後の課題である。250K蛋白質のアミノ酸配列:ROS蛋白質をSDSPAGE後、ニトロセルロース膜にウェスタンブロットし、アミノ末端からのアミノ酸配列をエドマン分解法で解析した。Met-Ser-Phe-Gly-Ala-Liys-Val-?-Leu-Leu-?-Glu-Asp-Arg-Asp-Arg-His-Ileu……となり、mRNAのcDNAを調製する一定の足がかりを得た。他の臓器の他のイオンチャンネル蛋白質の一次構造上の類似はみられなかった。考察:我々は電気生理学的方法により、cGMPに関係したイオンチャンネルを報告した(J.Biochem.1987)。これはKochらの報告とも矛盾なく、我々の250K蛋白質はKmの高い(170μM)cGMP依存カチオンチャンネルと考えられる。250K蛋白質の純品までの精製とチャンネル活性の解析が今後の課題である。なお、ウシのROSの分子量220K蛋白質について、ヌクレオチド結合活性とNa^+-Ca^<2+>エクスチェンジャー活性の報告がなされたが、いずれもcGMPとは無関係である。

A study of the existence of two proteins with molecular weights of 63 K (66 K) and 250 K in vertebrate rod outer segments (ROSs) was carried out in this paper (e.g. Biophysics 28, 152 - 155, 1988). This study focused on the analysis of 250K protein, and the following progress was achieved. 250 K protein purification: ROS, sucrose floating method, CHAPS, solubilization, 5 - 20% sucrose density, remote method SDS PAGE 250 K protein analysis confirmed cAMP release (cGMP release) after adsorption EDTA and KCl release. The highest purity is about 50%, and the operating conditions are expected to improve. The detection of protein production activity: partial purification of 250 K protein analysis and synthesis of Cook's method was successful (Biophysics, 28, S209, 1988). The stability and purity of 250 K protein in the solution are discussed in the future. 250K Protein Disorder: ROS Protein Disorder Analysis by SDSPAGE and Decomposition Method Met-Ser-Phe-Gly-Ala-Liys-Val-?- Leu-Leu-?- Glu-Asp-Arg-Asp-Arg-His-Ileu........................................................ The primary structure of the protein is similar to that of other proteins. A study of electrophysiological methods and cGMP relationships was presented (J. Biochem. 1987). The 250 K protein is Km high (170 μ M) and cGMP dependent. The purification of 250K protein and the analysis of its biological activity are the future problems. There are many reports on the molecular weight of 220K proteins such as Na ^+, Tashi ROS, and Na ^+-Ca ^<2 +> Ekusechin activity, and there is no relationship between cGMP and cGMP.

项目成果

岩本昌之 篠沢隆雄: 化学教育研究.

Masayuki Iwamoto 和 Takao Shinozawa：化学教育研究。

Salehi,S.A;Takagi,M.;Shinozawa,T.;Matsuura,T.: J.J.Physiol.

Salehi，S.A；Takagi，M.；筱泽，T.；松浦，T.：J.J.Physiol。

藤沢隆雄 松坂浩 鈴木教世: 生物物理. 28. 152-155 (1988)

Takao Fujisawa、Hiroshi Matsuzaka、Noriyo Suzuki：生物物理学。28. 152-155 (1988)

篠沢隆雄,福永晋哉,山下伸典: "3',5'サイクリックヌクレオチド。(情報生物シリーズ II.神経情報伝達分子:葛西道生、吉岡享、木島博正、塚原保夫、栗原堅三、鈴木英雄 共編)" 培風館, 61-71 (1988)

Takao Shinozawa、Shinya Fukunaga、Nobunori Yamashita：“3,5环核苷酸。（信息生物学系列II。神经信息传递分子：由Michio Kasai、Satoru Yoshioka、Hiromasa Kijima、Yasuo Tsukahara、Kenzo Kurihara、Hideo Suzuki共同编辑））”百福刊，61-71（1988）

Fukunaga,S.;Horiguchi,H.;Iwamoto,M.;Shigenobu,Y.& Shinozawa,T.: Microbiol.Immunol.32. 115-117 (1988)

福永，S.；堀口，H.；岩本，M.；重信，Y.