酵素免疫測定法の食品添加物分析への応用ー天然着色料の分析法の開発ー

1.免疫原及び抗原の作成:天然着色料として、Phycocyanin(青色)、Carmic acid(赤色)、Bixin(黄色)を選んだ。Phycocyaninはスピルリナ色素(三栄化学工業株式会社)を50%sat.(NH_4)_2SO_4で塩析した後、GFAー50(7.6x500mm)カラムによるゲルクロマトグラフイ-で精製し、これを免疫原および抗原とした。Carmic acidおよびBixinはその活性エステルをN,N′ーDicyclohexylcarbodiimideとNーHydroxysuccinimideを用いて合成し、キャリヤ-(免疫原はHuman IgGに、抗原はBovine serum albuminに)に結合させて作成した。2.免疫及び細胞融合:6週令のマウス(♀,A/J)にComplete Freund's Adjuvantと共にそれぞれの免疫原を腹腔内に投与した。5週間後に抗原のみで再度免疫し、3日後に免疫した脾細胞を取り出しX63ーAg8ー6.5.3.細胞とポリエチレングリコ-ル(MW=1,500)を用いて細胞融合を行なった。3.抗体のスクリ-ニング及びクロ-ニング:抗体の測定はポリスチレン製96ーwellーplatesにそれぞれの抗原をコ-トした物を用いて測定した。また限界希釈法を用いてクロ-ニングを行なった結果、PhycocyaninおよびCarmic acidに対してそれぞれ13クロ-ンのモノクロナ-ル抗体産生細胞が得られた。しかしながらBixinに対する抗体は得る事が出来なかったので、使用したマウスの抗血清を用いて抗体価を測定し、再度免疫をして細胞融合を行う予定である。4.マウス抗色素モノクロナ-ル抗体の特異性及び酵素免疫測定法の確立:培養上清中からモノクロナ-ル抗体を精製し、この抗体を使用してPhycocyaninにおいてはSandwich assayを、Carmic acidにおいてはInhibition Assayを用いた系を作成中である。さらにこれらの系を使用して、実際の食品中の天然色素量を測定する計画である。

1.免疫原及び抗原の作成:天然着色料として、Phycocyanin(青色)、Carmic acid(赤色)、Bixin(黄色)を選んだ。Phycocyaninはスピルリナ色素(三栄化学工業株式会社)を50%sat.(NH_4)_2SO_4で塩析した後、GFAー50(7.6x500mm)カラムによるゲルクロマトグラフイ-で精製し、これを免疫原および抗原とした。Carmic acidおよびBixinはその活性エステルをN,N′ーDicyclohexylcarbodiimideとNーHydroxysuccinimideを用いて合成し、キャリヤ-(免疫原はHuman IgGに、抗原はBovine serum albuminに)に結合させて作成した。2.免疫及び細胞融合:6週令のマウス(♀,A/J)にComplete Freund's Adjuvantと共にそれぞれの免疫原を腹腔内に投与した。5週間後に抗原のみで再度免疫し、3日後に免疫した脾細胞を取り出しX63ーAg8ー6.5.3.細胞とポリエチレングリコ-ル(MW=1,500)を用いて細胞融合を行なった。3.抗体のスクリ-ニング及びクロ-ニング:抗体の測定はポリスチレン製96ーwellーplatesにそれぞれの抗原をコ-トした物を用いて測定した。また限界希釈法を用いてクロ-ニングを行なった結果、PhycocyaninおよびCarmic acidに対してそれぞれ13クロ-ンのモノクロナ-ル抗体産生細胞が得られた。しかしながらBixinに対する抗体は得る事が出来なかったので、使用したマウスの抗血清を用いて抗体価を測定し、再度免疫をして細胞融合を行う予定である。4.マウス抗色素モノクロナ-ル抗体の特異性及び酵素免疫測定法の確立:培養上清中からモノクロナ-ル抗体を精製し、この抗体を使用してPhycocyaninにおいてはSandwich assayを、Carmic acidにおいてはInhibition Assayを用いた系を作成中である。さらにこれらの系を使用して、実際の食品中の天然色素量を測定する計画である。