胸腺内アセチルコリン受容体様蛋白に対するモノクロ-ナル抗体の作製に関する研究

胸腺内乙酰胆碱受体样蛋白单克隆抗体的制备研究

• 批准号: 03670428
• 负责人: 川浪 祥子
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Fukuoka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1991
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1991 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03670428/
• 关键词: アセチルコリン受容体様蛋白; 牛胎仔胸腺; ヒト重症筋無力症胸腺; 培養胸腺上皮細胞; 実験的重症筋無力症; 抗アセチルコリン受容体様蛋白抗体

(1)牛胎仔胸腺から,cobrotoxinーSepharose 4Bを用いたaffinity chromatographyにより,nicotinic acetylcholine receptorlike protein(AChRーLP)を分離した。これを抗原として家兎に免疫し、抗AChRーLP抗体を得た。(2)#1の抗体を用いて,ヒト重症筋無力症(Myasthenia gravis,MG)患者の過形成胸腺をVectastainのABCーalkaline phosphatase kitで染色すると、胸腺髄質に、島状に陽性細胞が見い出された。(3)胸腺から,このAChRーLP陽性細胞を分離する目的でMGの治療のために行われた胸腺摘出術の際に得られた,ヒトMG胸腺の培養を,日立の安全キャビネットを用いて開始した。MGの過形性胸腺では,primary cultureにおいて,胸腺上皮細胞が認められ,胸腺腫においては,その継代が可能であった。これらの培養胸腺組織細胞をdetergentで可容化し,SDSーpolycrylamidegel電気泳動を行い,dot blotter(Bio Dot),抗AChRーLP抗体を用いて,その蛋白抗原に対し,Western blotを行う予定で研究を進めている。(5)これらの細胞にAChRーLPの存在を確認し,その分画を分離し,それらに対するモノクロ-ナル抗体を作製するためにLewis ratまたは,C57B1/6 mouseに免疫する予定である。これらの免疫動物の脾細胞から,抗体産生細胞を検出するために,dot blotter(Bio Dot)を用いる。(6)牛胎仔胸腺から分離した,AChRーLP蛋白をcomplete Freund's adjuvant,百日咳ワクチンとともにLewis ratに免疫し,実験的重症筋無力症(experimental autoimmune myasthenia gravis EAMG)を発症させた。AChRーLPに対する血清抗体を酵素抗体法(Enzymeーlinked immunosorbent assay ELISA)で測定すると,その上昇には,初回免疫の第2週,第3週後に,booster,追加免疫が必要であった。(7)これらのEAMG ratの脾細胞を分取し,培養を開始している。(日立安全キャビネットを使用)これらの抗体産生細胞とmouse myeloma cellとのhybridizationをpolyethylene glycolを用いて行い,Bio Dotを用いて,抗体産生細胞を検出し,クロ-ンを作製していく予定である。

(1)Sepharose 4B was isolated from fetal bovine thymus by affinity chromatography,nicotinic acetylcholine receptorlike protein(AChR LP). Antigen and anti-AChR-LP antibodies were obtained. (2)#1 Antibodies were used in patients with myasthenia gravis (MG), and Vectastain ABC alkaline phosphatase kit staining, thymic cytoplasm, and island-like positive cells were found in the thymus. (3)The isolation of AChR-LP positive cells for the treatment of MG was carried out at the time of thymus extraction, and the culture of MG was carried out at the time of Hitachi's safety. MG's transitional thymus is not,primary culture is not, thymic epithelial cells are not, thymic swelling is not, and generation is possible. In this study, the detergent of cultured thymocytes was detected,SDS polyacrylamide gel electrophoresis was performed,dot blotter(Bio Dot), anti-AChR LP antibody was used, and protein antigen was detected. Western blot was used to conduct preliminary studies. (5)The presence of AChR-LP in these cells was confirmed, and the results were isolated, and the Lewis rat and C57B1/6 mouse were pre-determined. Splenocytes from immunized animals are removed and antibody-producing cells are detected. Dot blotter(Bio Dot) is used. (6)Bovine fetal thymus is isolated, AChR-LP protein is complete Freund's adjuvant, whooping cough, Lewis rat immunity, experimental autoimmune myasthenia gravis EAMG. AChR-LP serum antibody Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) to determine the rise, the first immunization in the second week, the third week after the booster, additional immunization is necessary. (7)EAMG rat splenocytes were isolated and cultured. (Hitachi Safety Service) Antibody-producing cells, mouse myeloma cells, hybridization of polyethylene glycol,Bio Dot, antibody-producing cells, mouse myeloma cells, hybridization of polyethylene glycol.

项目成果

Kawanami,S.,Mori,S.: "Experimental autoimmune myasthenia gravis induced by acetylcholine receptorlike protein from fetal calf thymus"

Kawanami,S.,Mori,S.：“胎牛胸腺乙酰胆碱受体样蛋白诱导的实验性自身免疫性重症肌无力”

Kawanami,S.,Mori,S.,Kikuchi,M.,& Ueda,H.: "Acetylcholine receptorlike protein in the human hyperplastic thymus of patients with myasthenia gravis"

川波 S.、森 S.、菊池 M.、

Kawanami,S.,Mori,S.Kikuchi,M.: "Acetylcholine receptorlike protein in the spleen"

Kawanami,S.,Mori,S.Kikuchi,M.：“脾脏中的乙酰胆碱受体样蛋白”