毛根部のない毛髪を用いたDNAタイピング-HLADQA1および性別判定-

使用无根头发进行 DNA 分型 - HLADQA1 和性别确定 -

• 批准号: 05770305
• 负责人: 玉城 尚
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: University of the Ryukyus
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05770305/
• 关键词: 毛髪; DNAタイピング; PCR; HLA-DQA1; メラニン

1本の毛髪、しかも毛根部のない試料を用いてDNAタイピングを行う目的で、毛幹部からのDNA抽出方法を検討した。研究計画に記載した方法、即ち毛髪を圧挫して緩衝液に浮遊させ、95℃加熱、氷冷を2回繰り返し、エーテル抽出により脂溶性の夾雑物を除去した後、エタノール沈殿にてDNAを調製する方法では、充分量のDNAが抽出されず、HLA-DQA1遺伝子型判定ならびに性別判定ともに不可能であった。そこで、Higuchiらの方法によって、proteinaseKを用いてDNAを抽出する方法を試みた。この方法で抽出したDNAを使用して、性別判定用のプライマーでPCRを行った後、電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した。その結果、明瞭なバンドは確認されず、性別判定は不可能であった。しかし、HLA-DQA1のプライマーを用いてPCRを行い、逆ブロットハイブリダイゼーションすると、HLA-DQA1の遺伝子型判定が可能な場合があった。HLA-DQA1遺伝子型は、性別よりも高感度で検出できる場合が多かったが、常に正確な判断ができるとはいい難かった。これは、この方法であっても、抽出されるDNA量が少なすぎるためと思慮される。DNAの分解をより抑えるために、抽出温度を室温・37℃及び55℃として検討した結果、抽出温度が高いほど抽出液が黒褐色を呈し、メラニンが混入してくることが判った。これを用いてPCRしたところ、メラニンのPCR反応阻害が著明であり、DNA増幅がなされなかった。そこで、吉井らの方法によって水溶性メラニンの簡便除去法を行った後PCRした結果、PCR反応阻害はなくなったが、上記同様、常に正確な判定ができる程のDNA量を得ることができなかった。PCRの増幅回数を30回から50回に増加した場合でも、型判定の正確度を高めることはできなかった。今後、プライマー及びPCRの反応条件を再検討したい。

1. To investigate the DNA extraction method of hair roots and hair roots. The research project describes methods for DNA modulation, including: pH control, buffer suspension, heating at 95 ℃, cooling at 2 cycles, extraction of fat-soluble impurities, extraction of sufficient DNA, HLA-DQA 1 genotype determination, and gender determination. Higuchi's method of extracting DNA from human genome was tested. This method extracts DNA and uses it, performs PCR for gender determination, and then conducts electrical migration and The result is clear, the gender determination is impossible, and the gender determination is impossible. HLA-DQA1 gene typing is possible when PCR is used. HLA-DQA 1 gene type, gender, high sensitivity, high sensitivity The method of extracting DNA from a sample is described in detail below. DNA decomposition, extraction temperature, room temperature, 37 ℃ and 55 ℃, extraction temperature, extraction solution, brown color, extraction temperature, extraction temperature This is the first time that we've seen this. The PCR results and PCR reactions were recorded in the same way as above, and the DNA amount of the process was always determined correctly. The number of PCR cycles increased from 30 cycles to 50 cycles, and the accuracy of type determination increased from 30 cycles to 50 cycles. In the future, we will discuss the conditions of PCR reaction.