DNAプローブを用いた根管内細菌検査法の確立

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現在臨床で使用されている根管内細菌検査法では、偏性嫌気性菌の検出が困難である。本研究では偏性嫌気性菌の正確・迅速な細菌検査法の確立を目的とし、DNAプローブハイブリダイゼーション法の根管内細菌検査法への応用について検討を行った。実験にはPorphyromonas gingivalisのオリゴデオキシヌクレオチドをプローブとして使用した。プローブの特異性を検討するためにPorphyromonas gingivalis、Bacteroides intermedius、B.forsythus、Wolinella recta、P.endodontalisの4菌種を選択した。各菌種はそれぞれ液体培地にて一晩培養しナイロンメンブレンにスポット・固定した。P.gingivalisに対して特異的なオリゴデオキシヌクレオチドプローブ(CAATACTCGTATCGCCCGTTATTC)をDNAシンセサイザーで合成し、^<32>P-ATPで標識したものとhorseradish peroxide comprex(以下HRPと略;後にルミノールで蛍光標識)で標識したものの二種類を作製、それぞれ通法に従いハイブリダイゼーションを行い現象(^<32>P-ATP標識プローブは1から5日間)後、P.gingivalisプローブの特異性と感度について比較検討を行った。その結果、^<32>P-ATPで標識したものはP.gingivalisに特異的に10^6の菌数まで確認することができたのに対して、HRPで標識したものについては10^8までの菌数は確認できたが特異性については^<32>P-ATPで標識したものに比べて劣っていた。以上の結果から、今回用いたオリゴヌクレオチドプローブは放射性同位元素で標識した場合には特異性のあることが確認できたが、根管内から採取できる滲出液量を考慮した場合には検出限界に問題のあることが確認された。従って今後の課題としてPCR法による遺伝子の増幅等を用いて検出限界の上昇を図る必要性が考えられた。