複合体形成時における蛋白性プロテアーゼインヒビターSSIの反応部位の構造研究--SSIのP1位カルボニル炭素の^<13>C-NMRシグナルのケミカルシフト変化の原因について

蛋白质蛋白酶抑制剂SSI复合物形成过程中反应位点的结构研究--SSI的P1羰基碳^13C-NMR信号化学位移变化的原因

• 批准号: 05780481
• 负责人: 矢田 洋子
• 金额: $ 0.51万
• 依托单位: Tokyo Metropolitan University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05780481/
• 关键词: プロテアーゼインヒビター; ^<13>NMR; 安定同位体標識; 切断結合

本研究では、蛋白性プロテアーゼインヒビターの阻害機能の原因を明らかにするために、その切断結合(P1位残基)主鎖カルボニル炭素が複合体形成時にプロテアーゼの活性セリン残基からの影響受けているか、それが阻害機能の鍵であるか否かを明確にすることをめざした。プローブとしてP1位主鎖カルボニル炭素の^<13>C-NMR化学シフトを用い、インヒビターとしてSSI及びそのアミノ酸置換異体を用いた。SSIのP1位カルボニル炭素シグナルは、サブチリシンBPN'との複合体形成に伴って低磁場に3.7ppmシフトした。この大きな低磁場シフトが阻害機能の鍵であるかを検討するために、P1位をArg及びPheに変換した変異体SSIを用いて、複合体形成に伴うP1位カルボニル炭素の化学シフト変化を観測し、阻害定数(ki値)との関係を検討した。これらの変異体SSIは三浦らによって作成され、サブチリシンBPN'(SUB)に対する阻害活性は殆ど野生型と変わらず(Ki=10^<-11>-10^<-12>M^<-1>)、又M73Rはトリプシン(T)を強く阻害し(10^<-9>M^<-1>)M73Fはキモトリプシン(CHT)を阻害する(10^<-7>M^<-1>)ことが報告されている。結果は、次のようであった。M73F(P1;Phe)-SUB系では、野生型SSI(P1;Met)-SUB系とほぼ同じ3.7ppmの大きな低磁場シフトが観測された。また、Kiの10^4低いM73F-CHT系でも3.0ppmと大きな低磁場シフトが観測された。一方、M73R(P1;Arg)-SUB系及び、Kiが10^2低いM73R-T系ともほぼシフト変化はなかった。このことから、P1位主鎖カルボニル炭素の複合体形成に伴う化学シフトの大きな変化は、阻害活性の大きさよりも、P1位残基の種類(又はその疎水性の度合)に強く関係していることが明らかになった。このことは、P1位主鎖カルボニル炭素は活性セリン残基から大きな影響受けはおらず、そのシフトは遊離及び複合体におけるSSIのP1位側鎖の立体構造の違いを反映していることが示唆された。

In this study, the reasons for the inhibition function of protein were clarified, and the main lock of protein was cut off. C-NMR <13>chemical analysis of carbon atoms at the P1 site, and their use in SSI and other acid substitutions. SSI's P1-bit carbon complex formation is accompanied by low magnetic field at 3.7 ppm. The relationship between the high magnetic field and the low magnetic field is discussed. The relationship between the high magnetic field and the low magnetic field is discussed. The relationship between the high magnetic field and the low magnetic field is discussed. The protective activity of these three different SSI inhibitors varied from wild-type (Ki=10^<-11>-10 ^<-12>M^<-1>) to M73R (T) and M73F (CHT) to strong (10 <-9><-1>^<-7>M^<-1>). The result is that the second time, the second time, the third time. M73F (P1;Phe)-SUB system is the same as wild-type SSI(P1;Met)-SUB system, which has a high magnetic field of 3.7 ppm. Also, the Ki of 10^4 low M73F-CHT system has a high magnetic field of 3.0 ppm and can be measured. M73R (P1;Arg)-SUB system and Ki-10^2 low middle M73R-T system The formation of carbon complexes is closely related to the chemical composition, inhibitory activity, and type of residues at P1 position (and the degree of hydration). The P1-site main lock of SSI is reflected in the stereostructure of the P1-site side lock.