大腸菌ATP依存性プロテアーゼLonの基質特異性とタンパク質分解シグナルの検索

寻找大肠杆菌 ATP 依赖性蛋白酶 Lon 的底物特异性和蛋白水解信号

• 批准号: 05858086
• 负责人: 村松 知成
• 金额: $ 0.51万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05858086/
• 关键词: 大腸菌; ATP依存プロテアーゼ; プロテアーゼ; ATPアーゼ

ATP依存性プロテアーゼはタンパク質分解の際ATPを加水分解するユニークなプロテアーゼ群で,細胞内の異常タンパク質の分解にかかわっている.申請者はこの中で最も単純な分子構成を持つ大腸菌のプロテアーゼLon(プロテアーゼLa)に着目し,その構造機能相関の研究をおこなっている.今年度は,以下の結果を得た.1)プロテアーゼLonの大量発現・精製系の確立 T7 RNA polymerase を用いた大量生産系を作成し,phosphocellulose,SephacrylS-300の2本のカラムクロマトグラフィーによる簡便な精製系を確立した.これを用いれば,短期間(4日以内)に大量の完全精製標品(1lの培養液より約10mg)を得ることができる.また,精製過程および保存溶液中に30%グリセロールを添加することによりこの酵素の安定性を向上させることができることを見いだした.短期間に高純度までに精製することとグリセロールの添加により精製標品の安定性は飛躍的に向上した.従来の報告では4℃の保存において精製標品は1日で30〜40%失活するとされていたが,申請者の精製標品は同一条件下2ヶ月間経過しても活性の低下は全く見られなかった.2)X線結晶構造解析へ向けての結晶化の試み 上記のように完全精製プロテアーゼLonは4℃で比較的安定であることがわかったので,4℃おいてhanging drop法により結晶化をを試みた.現在までに,約1000通りの条件を試みており,球晶を得ている.さらに条件検討を進めて単結晶を得て,構造解析を行う予定である.これが成功すればATP依存性プロテアーゼの中では構造が決定された初めてのものとなる.

ATP dependent degradation occurs when ATP is hydrolyzed, and abnormal degradation occurs in cells. The applicant is interested in the purest molecular composition of E. coli and its related research on structure and function. This year, the following results were obtained: 1) Establishment of mass production and purification system of T7 RNA polymerase using phosphocellulose, Sephacryl S-300 and 2) Establishment of simple purification system. In short term (within 4 days), a large amount of completely purified standard (1l of culture medium, about 10mg) was obtained. 30% of the enzyme stability in the purification process In the short term, high purity products are refined, and the stability of refined standards is improved. In the report, the refined standard sample stored at 4℃ was inactivated by 30 ~ 40% within 1 day, and the refined standard sample of the applicant was inactivated by 30 ~ 40% within 2 months under the same conditions. 4℃ hanging drop method Now, about 1000 pass conditions are tested, spherulites are obtained. The conditions for the analysis of the structure are discussed in detail. The success of the ATP dependency is determined by the structure of the initial stage.

项目成果

Masaru Tanokura: "A New Crystal From of Proteinase A,a Non-Pepsin-Type Acid Proteinase from Aspergillus niger var.macrosporus" Journal of Biochemistry. 114. 457-458 (1993)

Masaru Tanokura：“蛋白酶 A 的新晶体，一种来自黑曲霉大孢子菌的非胃蛋白酶型酸性蛋白酶”《生物化学杂志》。

Masaru Tanokura: "x-ray study of Proteinase A,a non-pepsin-type acid proteinase from Aspergillus niger var.macrosporus" Photon Factory Activity Report. 10. 99-99 (1993)

Masaru Tanokura：“蛋白酶 A 的 X 射线研究，蛋白酶 A 是一种来自黑曲霉大孢子菌的非胃蛋白酶型酸性蛋白酶”光子工厂活动报告。