グルコース輸送体2からのインスリン分泌シグナル伝達機構の解析

葡萄糖转运蛋白2的胰岛素分泌信号转导机制分析

• 批准号: 06770825
• 负责人: 大久保 久美子
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Fukuoka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06770825/
• 关键词: グルコース輸送体2; インスリン分泌; AtT20

1.AtT20ins細胞の作製とインスリン分泌の確認AtT20/D16v-F2(ATCC♯CRL1795)細胞に、ヒトインスリン遺伝子(cDNA)を発現ベクターpCXNに組み込んだpCXNhINSを、lipofectinを用いて導入し、G418にて選択後、クローン化したAtT20ins細胞を作製した。この細胞をロ-ダミン標識抗ヒトインスリン抗体で免疫蛍光染色したところ、分泌顆粒の存在する突起部分に蛍光の局在が認められ、導入したヒトインスリン遺伝子がAtT20細胞で発現し、分泌顆粒に正確に到達していることが確認された。2.GLUT1,GLUT2発現ベクターの作製とAtT20ins細胞への遺伝子導入ヒトグルコース輸送体1(GLUT1)および2(GLUT2)のcDNAはATCCより購入した(_<59631,>61613)。両者の遺伝子を各々、pCEP4発現ベクター(Invitrogen)のサイトメガロウイルスプロモーター下流に挿入し、pCEP4hGLUT1およびpCEP4hGLUT2の二種類の発現ベクターを作製した。両ベクターを塩化セシウム密度勾配遠心法で分離精製後、lipofectinを使ってAtT20ins細胞に導入した。現在、ハイグロマイシンBを用いてstable transformantを選別しつつ、transient expressionにてAtT20insGLUT1細胞およびAtT20insGLUT2細胞における、グルコース刺激によるインスリン分泌を観察中である。

1. の AtT20ins cells cropping と イ ン ス リ ン secretion の confirm AtT20 / D16v - F2 (ATCC ♯ CRL1795) cell に, ヒ ト イ ン ス リ ン heritage 伝 child (cDNA) を 発 now ベ ク タ ー pCXN に group み 込 ん だ pCXNhINS を, lipofectin を with い て import し, G4 18にて select 択, then <s:1> ロ <s:1> and ロ are homogenized to <s:1> たAtT20ins cells を for <s:1> た preparation. こ の cells を ロ - ダ ミ ン identity resistance ヒ ト イ ン ス リ で ン antibody immune 蛍 light staining し た と こ ろ, secretory granules exist の す る protrusion に 蛍 light の bureau at が め ら れ, import し た ヒ ト イ ン ス リ ン heritage 伝 son が AtT20 cells で 発 し, secretory granules に に arrived right し て い る こ と が confirm さ れ た. 2. GLUT1, GLUT2 発 now ベ ク タ ー の cropping と AtT20ins cells へ の posthumous son 伝 import ヒ ト グ ル コ ー ス transport volume 1 (GLUT1) お よ び 2 (GLUT2) の cDNA は ATCC よ り buy し た (_ < 59631 > 61613). That struck the の heritage 伝 を each 々, pCEP4 発 now ベ ク タ ー (Invitrogen) の サ イ ト メ ガ ロ ウ イ ル ス プ ロ モ ー タ ー obscene に scions into し, pCEP4hGLUT1 お よ び pCEP4hGLUT2 の two kinds の 発 now ベ ク タ ー を cropping し た. That struck ベ ク タ ー を salt chemical セ シ ウ ム density hook far art で separation after refining, lipofectin を make っ て AtT20ins cells に import し た. Now, ハ グロ グロ シ シ シ Bを uses the を てstable transformantを to select を and transient Expression に て AtT20insGLUT1 cells お よ び AtT20insGLUT2 cells に お け る, グ ル コ ー ス stimulus に よ る イ ン ス リ ン secretion を 観 examine the で あ る.