グルコース輸送体2からのインスリン分泌シグナル伝達機構の解析

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1.AtT20ins細胞の作製とインスリン分泌の確認AtT20/D16v-F2(ATCC♯CRL1795)細胞に、ヒトインスリン遺伝子(cDNA)を発現ベクターpCXNに組み込んだpCXNhINSを、lipofectinを用いて導入し、G418にて選択後、クローン化したAtT20ins細胞を作製した。この細胞をロ-ダミン標識抗ヒトインスリン抗体で免疫蛍光染色したところ、分泌顆粒の存在する突起部分に蛍光の局在が認められ、導入したヒトインスリン遺伝子がAtT20細胞で発現し、分泌顆粒に正確に到達していることが確認された。2.GLUT1,GLUT2発現ベクターの作製とAtT20ins細胞への遺伝子導入ヒトグルコース輸送体1(GLUT1)および2(GLUT2)のcDNAはATCCより購入した(_<59631,>61613)。両者の遺伝子を各々、pCEP4発現ベクター(Invitrogen)のサイトメガロウイルスプロモーター下流に挿入し、pCEP4hGLUT1およびpCEP4hGLUT2の二種類の発現ベクターを作製した。両ベクターを塩化セシウム密度勾配遠心法で分離精製後、lipofectinを使ってAtT20ins細胞に導入した。現在、ハイグロマイシンBを用いてstable transformantを選別しつつ、transient expressionにてAtT20insGLUT1細胞およびAtT20insGLUT2細胞における、グルコース刺激によるインスリン分泌を観察中である。