無脊椎動物視細胞における光伝達系に関与する効果器の同定

鉴定参与无脊椎动物感光细胞光转导系统的效应子

• 批准号: 06780541
• 负责人: 中川 将司
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: Himeji Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06780541/
• 关键词: 無脊椎動物視細胞; PLC; G蛋白質; シグナル伝達機構

1精製 タコ網膜からショ糖密度勾配法により得られた視細胞膜を等張バッファ(400mMKC1)で懸濁した後、遠心したところ上清部分に高いホスホリパーゼC(PLC)活性が見られた。これを出発物質として以下の精製を行った。一般にPLCはヘパリンと高い親和性があることが知られているのでまずヘパリンカラムにかけた。400mMNaClで溶出されてくる分画に高いPLCの活性が見られた。電気泳動パターンでは、哺乳類のPLC_βの分子量150kDaに近い135kDaにバンドが見られる他に低分子量側に数本のバンドが見られた。この分画をさらにゲル濾過カラム(Suprerose6)、陽イオン交換カラム(Mono-S)を用いて精製を行った。その結果、SDS-PAGEで135kDaに単一バンドを示すPLC標品が得られた。最終的にタコ目玉67ヶから420μgのPLCが得られ、PIP_2の加水分解活性は30μMCa濃度の時1.33μmol/min/mgであった。2性質 PLCの活性のCa^<2+>濃度依存性を調べた。10nMのCa^<2+>濃度では殆ど活性はないが、Ca^<2+>濃度を上げていくと活性は上昇し10〜100μMで最大値に達した。さらに濃度を上昇させると1mM以上では急激に活性は下がった。Mg^<2+>は用量依存的にPLC活性の阻害を示し、2.5mMでその活性は完全に消失した。活性の至適温度は30であった。哺乳類のPLC活性の至適温度37であるが、タコ視細胞PLCは37では活性が下がった。3G蛋白質による活性化 タコ視細胞から精製したG蛋白質(Gqp)をAlF_4^-またはGTP_γSで活性化しこれによるPLCの活性を調べた。現在の所期待通りのG蛋白質によるPLCの活性上昇は見られなかった。用いたG蛋白質が可溶性でうまくPLCと共役出来なかったのか、またはG蛋白質の活性化に不可欠なMg^<2+>が逆にPLCの活性を阻害した可能性もある。現在再構成系でのPLCの活性化を再検討中である。(本研究は同研究室の吉川知志氏と共に行った。)

1. Refined retinal membrane isotonicity (400 mM KC1) was obtained by glucose density matching method. The supernatant of supernatant was isolated from supernatant by PLC. The material is refined. A common PLC is a high degree of harmony. 400 mM NaCl dissolution rate is higher than that of HPLC activity. The molecular weight of mammalian PLC_β is 150kDa and the molecular weight of mammalian PLC_β is 135kDa. The separation of these components is carried out by means of filtration (Suprerose6) and positive exchange (Mono-S). The results, SDS-PAGE, showed that the PLC standard was obtained at 135kDa. The final concentration of PIP_2 was 1.33μmol/min at a concentration of 420μg PLC. 2. The Ca^<2+> concentration-dependence of PLC activity was modulated. Ca ^<2 +> concentration at 10nM increased activity to 10 ~ 100μM maximum. When the concentration increases above 1mM, the activity decreases. Mg^<2+> inhibited PLC activity in a dose-dependent manner, but the activity disappeared completely at 2.5 mM. The activity reaches the optimum temperature of 30 ℃. Mammalian PLC activity reaches the optimum temperature of 37 ℃, and the PLC activity of the visual cell is 37 ℃. 3G protein is activated in the cell line and purified by AlF_4^-GTP_γS, which regulates PLC activity. Now we are expecting a rise in PLC activity through G protein. The solubility of G protein can be prevented by PLC, and the activation of G protein can be prevented by Mg^<2+>. Now the re-constitution of PLC activation is under discussion. (This study was conducted in the same laboratory as Tomoshi Yoshikawa.)