Heteroduplex解析法による進行性筋ジストロフィー症の点変異の検出

使用异源双链分析方法检测进行性肌营养不良症的点突变

• 批准号: 07770162
• 负责人: 平石 佳之
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Keio University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07770162/
• 关键词: Duchenne型筋ジストロフィー; Becker型筋ジストロフィー; 遺伝子欠失; 遺伝子重複; ジストロフィン; 点変異; PCR; RNA

Duchenne型またはBecker型筋ジストロフィー(DMD,BMD)と診断された患者90例についてサザンブロット法を行い,70例にジストロフィン遺伝子の部分欠失や部分重複が検出された.このような異常が検出されなかった15例については,点変異などの微細なDNAの異常があると考え,Heteroduplex法に用いる対象となると考えた.その内の1名について,末梢血単核球(PBMC)から当研究室で開発されたRNA抽出法を用いてRNAを抽出し,逆転写反応後,PCR法を行いジストロフィンcDNAを合成した.同様に正常人からジストロフィンcDNAを合成し,両者を混合後,高温による変性を行い,徐々に温度を下げることによりheterodupulexを形成させ,電気泳動による点変異の検出を行った.しかし,この方法では点変異を検出することができなかった.そこで,点変異の検出方法を変更し,塩基配列決定を用いることにした.ジストロフィンcDNAはNested PCR法を用いて増幅した.1回目のPCR反応は,ジストロフィンcDNA14kbを10領域に分けて行い,2回目のPCR反応は,1回目の産物をさらに2〜3断片に分けて増幅し,塩基配列を決定した.その結果,7ヶ所で点変異が検出された.その位置は塩基番号で,4614番目のTがAに変異し(Len→Gln),5442番目のGがAに(Arg→His),5738番目のAがCに(変異なし),7304番目のCがAに(Gln→Lys),8937番目のAがTに(GLU→Val),8942番目のAがG(Asn→Asp),9458番目のGは欠失していた.最後の欠失によるフレームシフト変異は,その38ヌクレチド下流に終始コドンを生じさせていた.従って,このフレームシフトが対象者でのDMD発症の原因と考えられた.今後,残りの14例について塩基配列を決定し,DMD/BMD患者の遺伝的背景を解析したい.

Duchenne type ま た は Becker type steel ジ ス ト ロ フ ィ ー (DMD, BMD) と diagnosis さ れ た 90 cases of patients with に つ い て サ ザ ン ブ ロ ッ を line い ト method, 70 cases of に ジ ス ト ロ フ ィ ン posthumous son 伝 の parts owe lost や repeat が 検 out さ れ た. こ の よ う な abnormal が 検 out さ れ な か っ た 15 に つ い て は, points - different な ど の imperceptible な abnormal DNA の が あ る と え, に Heteroduplex method with い る like と seaborne な る と exam え た. そ の の within 1 に つ い て, peripheral blood 単 nuclear ball (PBMC) か ら when open laboratory で 発 さ れ た RNA extraction method を with い て to extract RNA を し, inverse planning to write after the 応, PCR method line を い ジ ス ト ロ フ Youdaoplaceholder0 を cDNAを synthesizes た. With others in に normal か ら ジ ス ト ロ フ ィ ン cDNA synthesis し を, struck を blend, high-temperature に よ る - line を い, xu 々 に を temperature げ る こ と に よ り heterodupulex を form さ せ, electric 気 swimming に よ る points - different の 検 を row っ た. し か し, こ の way で は points - different を 検 out す る こ と が で き な か っ た . そ こ で, point - different の を 検 out method - more し, salt base with column with を い る こ と に し た. ジ ス ト ロ フ ィ ン cDNA は Nested を PCR method with い て rights of し た. 1 pa2 の PCR anti 応 は, ジ ス ト ロ フ ィ ン cDNA14kb を に 10 field points け て い, 2 pa2 の PCR anti 応 は, 1 pa2 の product を さ ら に 2 ~ 3 fragment に points け て raised し, salt base with column を decided し た. そ の results, 7 ヶ で points - different が 検 out さ れ た. そ の position は salt Base mash で, 4614 mesh の T が A に - different し (Len - Gln), 5442's eye が の G A に (Arg - ihs), 5738's mesh の A が C に (- different な し), 7304's eye の C が A に (Gln - Lys), 8937's eye の A が T に (GLU - Val), 8942's mesh の が G A (Asn→Asp),9458 series <s:1> G た loss claim て て た た. Finally lost の owe に よ る フ レ ー ム シ フ ト - は, そ の 38 ヌ ク レ チ ド obscene に beginning コ ド ン を raw じ さ せ て い た. Youdaoplaceholder0, えられた フレ フレ ムシフトが ムシフトが ムシフトが the subject で <s:1> the cause of DMD occurrence と the examination えられた. In the future, the background of the cultural heritage of the remaining 14 cases of に, に, て, て and て of DMD/BMD patients will be determined by を.