巨核球分化における組織特異的転写因子p45NF-E2遺伝子の発現調節機構の解析

组织特异性转录因子p45NF-E2基因在巨核细胞分化过程中的表达调控机制分析

• 批准号: 07770556
• 负责人: 荒井 宏治
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Hirosaki University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07770556/
• 关键词: NF-E2 promotor

ヒトNF-E2cDNAをプローブとしてヒトgenomicNF-E2をヒトgenomic libraryより単離した。ヒトgenomic libraryは健常人のリンパ球からDNAを抽出してファージのベクターに組み込んだ。ベクターはEMBL3を用いた。単離したクローンを解析した。筆者はEF-E2遺伝子のプロモーター領域の興味があったため、その部分の構造解析を行った。プロモーター領域は5.2kbあり、種々の制限酵素で切ってみたところいくつかの認識部位を有していた。制限酵素の認識部位を利用して、5.2kb、4kb、1.2kb、600bpのインサートを作成し、東洋紡社のピカジーンベクターに組み入れた。ピカジーンによって発現された蛋白は蛍光により発光する。ピカジーンベクターに組み込まれた種々の大きさのコンストラクトをバクテリアに入れ、形質転換した。そしてそれらのバクテリアを大量培養し、プラスミドDNAを抽出した。これらのDNAを種々の細胞株に遺伝子導入した。主として用いたのは赤芽球前駆細胞株HELおよび骨髄芽球細胞株HL-60であった。細胞導入は電気穿孔法を用いた。遺伝子導入された細胞をRPMI1640,10%FCSにPMAを加えたもので3日間培養し、加えないものをコントロールとした。培養後細胞をSDSで融解し、蛍光分光光度計により発現を定量した。HEL細胞のものとHL-60細胞のものと比べると有意に前者の発光が高く本プロモーターは細胞特異的に機能しているものと考えている。しかしPMA刺激によりさらに機能の亢進が認められ、我々の予想に反していた。おそらく制作したプロモータのさらに上流にサイェンサー領域があり、それを含んでいないためと考えている。事実発光は0.6>1.2>4>5.2の順であり、大きいコンストラクト程活性は高い。現在塩基配列を決定し、転写活性に重要と考えられる部分を同定中である。本研究の要旨は今年度の臨床血液学会で発表し、論文としてまとめる予定である。

NF-E2 cDNA library is the most important part of the genome library. Genomic library is a collection of DNA from healthy individuals. EMBL3 is used. The reason for this is that The author analyzes the structure of EF-E2 gene in the field of interest. 5.2kb in the field of restriction enzymes. The recognition sites of restriction enzymes were used to construct the 5.2kb, 4kb, 1.2kb, 600bp protein sites, and the protein sites were assembled. The light source of the protein is the light source. The main purpose of this paper is to improve the quality of the products. A large number of culture and DNA extraction were carried out. DNA is introduced into cell lines. HEL-60 cell line is the first cell line to be used in this study. Cell introduction by electroporation was used. RPMI1640,10% FCS and PMA were introduced into the cells. After culture, the cells were thawed and quantified by SDS spectrophotometry. HEL cells have a unique function in HL-60 cells. The stimulation of PMA is very important for us to realize the hyperfunction of brain and brain. In addition to the above, it is also possible to increase the number of people in the field. The activity of the process is high. Now the base alignment is determined, and the activity is determined. The purpose of this study is to present the findings of this year's Clinical Hematology Society.