睡眠発現機序に関連する視床下部下垂体系を中心とした神経内分泌学的検討

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今年度はそれまでヒト成長ホルモン(GH)の分泌について、睡眠覚醒リズムとの関連について以前から行ってきた成果をまとめた。その結果、GHにはこれまで知られていた睡眠に依存する成分の他に固有の日内リズムが存在することを明らかにし、Journal of Neuroendocrinology上に発表した。次に、GRF(Growth Hormone Releasing Factor)の測定系を確立することに主眼をおいた。まず、これまでGHのエンザイムノアッセイで用いた、マレイミド・ヒンジ法による抗体作成法を応用しGRFにマレイミド・ヒンジを用いてBovine Serum Albumin(BSA)を結合させ、そのconjugateで野兎を免疫する方法を試みた。しかしGRFの分子構造から、GRFにチオール基を導入することが困難で、収率が非常に悪く、次にBSAにマレイミド基を導入したものとカップルさせるとわずかなGRF-BSA結合体しか生成できず、必要量を得るには大量にGRFを消費することから、このconjugateで野兎を免疫し抗血清を作成することは費用の面からも現実的ではないことがわかった。次にGRFのN端及びC端ペプチドとKLHの複合体を作成する方法を採り、この複合体を等量のアジェバントとともに乳化させたもので兎を免疫した。兎から得られた抗血清をHi Trap Protein Aカラム、KLH‐NHSカラムを用いて精製し、反応性を調べた。抗原をGRFとし固相抗体にProtein A精製した抗GRF抗体を2種類、すなわち抗GRF(1‐29)抗体(N端認識)と抗GRF抗体(30‐44)抗体(C端認識)を標識し二次抗体にそれぞれ同じ抗GRF抗体を用いたELISAで確認したところ、C端認識抗体で測定感度が0.1‐20ng/mlという結果を得た。しかし、この方法では従来のラジオイムノアッセイとほとんど大差なくより少量で高感度の抗体を得るべく現在同じ抗体作成法で検討中である。