脂肪細胞のTNF反応性と腹腔内脂肪沈着およびインスリン抵抗性との関連の検討

10週令の雄Balb/cマウスの腹腔内脂肪組織を用いてTNF-αの発現を検討した。細切した腹腔内脂肪組織に0℃でRNAzolを加えてhomogenizeし、choroform-isoamyl alcohol処理後14,000rpmで遠沈し、上清中のRNAをisopropranolで沈澱させた。得られたtotal RNAの1μgをcDNAに逆転写し、マウスTNF-α cDNAの168-187および448-467に相当するprimerを用いてPCRを行った。コントロールとしてはβ-actinのprimerを用いた。35サイクルの増幅によりTNF-αに一致する0.3kbのバンドが検出された。マウスにヒトNPHインスリン0.1単位を夕1回1週間皮下注射し、同様に腹腔内脂肪を取り出してRT-PCR法によりTNF-αのmRNAを検討した。インスリン注射後のマウスにおいてもTNF-αのmRNAのバンドが検出されたが、インスリンによる影響は明らかではなかった。そこでrandom primed法により[^<32>P]-dCTPでラベルしたDNAを用いてNorthern blot法による検討を試みた。RT-PCRと同様にして抽出したtotal RNAをアガロースゲルに1レーン当たり20μgで電気泳動し検討を行ったが、Northern blot法によっては腹腔内脂肪のTNF-α mRNAは検出できなかった。次に腹腔内脂肪をhomogenizeし、遠沈上清中のTNF-αをGenzymeのキットを用いてELISA法で測定したが、上清中のTNF-αはキットの感度以下であった。RT-PCRで脂肪組織のTNF-αが検出されているので、今後上清の濃縮などによりELISA法の感度を上げ、定量的な検討を行っていく予定である。

10週令の雄Balb/cマウスの腹腔内脂肪組織を用いてTNF-αの発現を検討した。細切した腹腔内脂肪組織に0℃でRNAzolを加えてhomogenizeし、choroform-isoamyl alcohol処理後14,000rpmで遠沈し、上清中のRNAをisopropranolで沈澱させた。得られたtotal RNAの1μgをcDNAに逆転写し、マウスTNF-α cDNAの168-187および448-467に相当するprimerを用いてPCRを行った。コントロールとしてはβ-actinのprimerを用いた。35サイクルの増幅によりTNF-αに一致する0.3kbのバンドが検出された。マウスにヒトNPHインスリン0.1単位を夕1回1週間皮下注射し、同様に腹腔内脂肪を取り出してRT-PCR法によりTNF-αのmRNAを検討した。インスリン注射後のマウスにおいてもTNF-αのmRNAのバンドが検出されたが、インスリンによる影響は明らかではなかった。そこでrandom primed法により[^<32>P]-dCTPでラベルしたDNAを用いてNorthern blot法による検討を試みた。RT-PCRと同様にして抽出したtotal RNAをアガロースゲルに1レーン当たり20μgで電気泳動し検討を行ったが、Northern blot法によっては腹腔内脂肪のTNF-α mRNAは検出できなかった。次に腹腔内脂肪をhomogenizeし、遠沈上清中のTNF-αをGenzymeのキットを用いてELISA法で測定したが、上清中のTNF-αはキットの感度以下であった。RT-PCRで脂肪組織のTNF-αが検出されているので、今後上清の濃縮などによりELISA法の感度を上げ、定量的な検討を行っていく予定である。