ホルマリン固定臓器からのトリアゾラムの免疫組織化学的検出法の開発

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ハプテンとしてトリアゾラム-4-HS(hemisuccinate)を合成した。アップジョン社から提供をうけた4-ハイドロキシトリアゾラムの水酸基に無水コハク酸を縮合させ、その後薄層クロマトグラフィーでトリアゾラム-4HSを二回精製し、ハプテンを得た。得られたハプテンを酸無水物法で牛血清アルブミン(BSA)と縮合させトリアゾラム-4-HS-BSAを合成し、流水で3日間透析した後に免疫源とした。この免疫源にはBSA 1molに対しハプテンが約10mol結合していた。免疫源1mgを0.5mlの生食に溶解させ、等量のフロイントの完全アジュバンドと混和させてミセルを形成させた後にBalb/cマウスの腹腔内に1匹当たり250μg注入した。追加免疫は1ケ月毎に行い、免疫源を生食に溶解させ、Balb/cマウス1匹当たり250μgを腹腔内に注入した。追加免疫は6ケ月間行い、最終免疫の3日後にマウスを屠殺し、脾臓を摘出した後にマウス骨髄腫細胞P3U1とポリエチレングリコールを用いて細胞融合を行った。その後、HAT培地によるハイブリドーマの選別を行い、ハイブリドーマの培養上清を試料としてELISA法によるスクリーニングを行った。スクリーニングでは免疫源のみ認識し、キャリアータンパクであるBSAは認識しないクローンのみを選別した。その結果、2個のクローンが得られ、現在限界希釈法による、クローニングを行い、抗トリアゾラム抗体産生クローンの確立を試みているところである。