マクロファージスカベンジャー受容体の細胞内輸送に関与する機能配列の探究

本研究では、近年動脈硬化発症の鍵分子として見つけられたスカベンジャー受容体について、細胞内へのリガンドの取り込み機構と、その機能構造を明らかにすることを目的に実験を行い、以下の事を明らかにした。1.受容体のリガンド取り込み機構を調べるにあたり、一サイクルのリガンド取り込み量を測定するアッセイ系を構築した。受容体を発現した細胞を4℃まで冷却し、エンドサイトーシスを停止した後、放射標識したリガンドを加え受容体にリガンドを結合させた。その後、温度を37℃に上げ、5分間インキュベートし、その間に取り込まれるリガンドの量を測定することにより、エンドサイトーシスの効率を測定することができた。2.構築したアッセイ系を用いて、マクロファージスカベンジャー受容体のN末端より20アミノ酸から30アミノ酸の範囲で、一箇所のアミノ酸をアラニンに置換した点変異体のリガンド取り込みや受容体の細胞表面上への発現量を測定した。その結果、リガンド取り込み効率には、N末端より21番目から29番目までのVxFDxxSVT配列が、また細胞表面への発現には、N末端より21番目から24番目までのVxFD配列が大きく関与していることを明らかにした。(これら変異受容体の細胞内での発現を、ウエスタンブロット解析により調べたところ、いずれも同程度の発現量が観察された。)これらの配列は、今までに知られていない新規なモチーフ配列である。3.変異受容体の細胞内での動態を詳しく調べるために、受容体発現細胞を固定し、スカベンジャー受容体に対する抗体を用いて免疫組織化学的に染色した。現在、電子顕微鏡を用いて、これら受容体の細胞内での局在を調べている。また、以上の結果をもとに、スカベンジャー受容体のエンドサイトーシス、及び細胞内輸送に関与する細胞内因子の単離、同定を試みている。

本研究では、近年動脈硬化発症の鍵分子として見つけられたスカベンジャー受容体について、細胞内へのリガンドの取り込み機構と、その機能構造を明らかにすることを目的に実験を行い、以下の事を明らかにした。1.受容体のリガンド取り込み機構を調べるにあたり、一サイクルのリガンド取り込み量を測定するアッセイ系を構築した。受容体を発現した細胞を4℃まで冷却し、エンドサイトーシスを停止した後、放射標識したリガンドを加え受容体にリガンドを結合させた。その後、温度を37℃に上げ、5分間インキュベートし、その間に取り込まれるリガンドの量を測定することにより、エンドサイトーシスの効率を測定することができた。2.構築したアッセイ系を用いて、マクロファージスカベンジャー受容体のN末端より20アミノ酸から30アミノ酸の範囲で、一箇所のアミノ酸をアラニンに置換した点変異体のリガンド取り込みや受容体の細胞表面上への発現量を測定した。その結果、リガンド取り込み効率には、N末端より21番目から29番目までのVxFDxxSVT配列が、また細胞表面への発現には、N末端より21番目から24番目までのVxFD配列が大きく関与していることを明らかにした。(これら変異受容体の細胞内での発現を、ウエスタンブロット解析により調べたところ、いずれも同程度の発現量が観察された。)これらの配列は、今までに知られていない新規なモチーフ配列である。3.変異受容体の細胞内での動態を詳しく調べるために、受容体発現細胞を固定し、スカベンジャー受容体に対する抗体を用いて免疫組織化学的に染色した。現在、電子顕微鏡を用いて、これら受容体の細胞内での局在を調べている。また、以上の結果をもとに、スカベンジャー受容体のエンドサイトーシス、及び細胞内輸送に関与する細胞内因子の単離、同定を試みている。