Notch細胞質領域のリガンド依存的な切断部位の特定、及びプロテアーゼの同定

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マウスNotch 1の細胞外領域を大部分欠失させたコンストラクト(ΔE)は、リガンド非依存的に膜貫通領域と細胞質領域の境界付近でprocessingを受けることが最近報告され、またこのprocessingはプロテアーゼ阻害剤の1つであるMG132によって阻害されることが示されている。MG132はプロテアソーム阻害剤である為、他のプロテアソーム阻害剤であるLactacystin、及びその誘導体であるclasto-Lactacystin β-lactonの効果を検討したが、ΔEのprocessingは阻害されなかった。Lactacystinはプロテアソーム特異的阻害剤であるのに対し、MG132はカルパインなど他のプロテアーゼも阻害することから、ΔEがカルパインである可能性が示唆されたが、カルパイン特異的阻害剤では効果がないことから、MG132はそれ以外のプロテアーゼを阻害している可能性が考えられる。またΔEのprocessingの程度が細胞の種類で異なるのかを検討したが、調べたすべての細胞でprocessingが認められた。Notchを発現していない細胞でもこのprocessingは認められることから、ΔEを切断するプロテアーゼはNotch蛋白質以外にも基質を持つものと考えられる。また我々は、マウスNotch 1の細胞質領域を大部分欠失させたコンストラクト(ECRAM)を安定に発現した細胞株(N6 cells)を樹立し、既に樹立済であるD10 cells(NotchリガンドであるDeltaを安定に発現した細胞株)と共培養したときにも同様にprocessingが生じ、やはりMG132によってそのprocessingを阻害されることを確認した。