分泌蛋白質の品質管理機構としての小胞体内蛋白分解メカニズムの解析

内质网蛋白降解机制作为分泌蛋白质量控制机制的分析

基本信息

批准号：
10163237
负责人：
小出武比古
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Himeji Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10163237/
关键词：
品質管理機構小胞体 20Sプロテアソーム小胞体プロテアソーム

项目摘要

小胞体(ER)に局在し、新生タンパク質の品質管理機構に関与する可能性のあるプロテアーゼを単離することを目的として、ラット肝ミクロソーム画分の0.0125%および2.5%コール酸ナトリウム可溶化画分より、合成基質Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA(LLVY)水解活性を指標として、R2プロテアーゼ(R2)およびDE3プロテアーゼ(DE3)を精製した。両プロテアーゼ共に、SDS-PAGE上では、20Sプロテアソーム(20S)のパターンときわめて類似する多数のサブユニットが検出された。しかし、2次元PAGEでは、3者のサブユニットのスポットの一部に相違が認められた。次に、両プロテアーゼの酵素化学的性質を細胞質20Sプロテアソーム(20S)との比較で検討した。各種の合成ぺプチド基質を用いて検討した結果、R2とDE3は20Sと同様の基質特異性を有していた。20Sに特徴的なSDSによるLLVY水解活性の増強については、R2とDE3は増強の程度が20Sのそれよりも強いことが認められ、ER膜のリン脂質組成を模倣したリン脂質混合物存在下でもR2、DE3のLLVY水解活性が20Sのそれよりも上昇した。また、検討した4種の合成基質の水解活性すべてにおいて、R2とDE3はプロテアソームの特異的阻害剤に対して20Sと同様の阻害剤感受性を示したが、TPCKやキモスタチンに対しては特定の合成基質の水解活性の阻害で若干の相違も認められた。しかし一方で、TPCKはBoc-Leu-Arg-Arg-MCA水解活性を増強するという興味深い現象が認められ、この場合の活性化倍率は、20SがR2、DE3よりも高かった。タンパク質基質を用いた検討では、R2とDE3は20Sと同様にintactなBSAやリゾチームはほとんど分解しなかったが、DE3は、一定の3次元構造を持たないといわれているβ-カゼインをよく分解した。また、還元カルボキシメチル化リゾチーム(RCM-Lz)に対しては、DE3は20Sよりはるかに分解活性が高く、これらプロテアーゼ間のタンパク質分解特性に差異が認められた。このように、R2とDE3は20Sと局在部位が異なることに加えて、酵素化学的特性においても幾つかの点で異なることが明らかとなった。

目的是隔离局部性网状（ER）的蛋白酶，并可能参与新生蛋白，R2蛋白酶（R2）和DE3蛋白酶（DE3）的质量控制机制，从0.0125％和2.5％的含钠溶解性级数中纯化了Rat Liver Microsom Al Microsom Al Synitions， Suc-Leu-Leu-Val-Val-Tyr-MCA（LLVY）作为指标。对于这两种蛋白酶，在SDS-PAGE上都检测到许多亚基，这些亚基与20S蛋白酶体（20s）的模式非常相似。但是，在第二页中，在三个亚基的某些斑点中观察到差异。接下来，与细胞质20S蛋白酶体（20s）相比，研究了两种蛋白酶的酶学化学。在使用各种合成肽底物进行研究后，R2和DE3显示出与20s相似的底物特异性。关于SDS的llvy水解活性的增强，这是20 s的特征，可以观察到，R2和DE3的增强程度比20S的增强程度更强，并且R2和DE3的LLVY水解活性的增长大于20S，即使在磷脂混合物的存在下，即使在磷酸化磷酸化的情况下，也可以粘贴磷脂的磷酸化合物。此外，在研究的所有四个合成底物中，R2和DE3表现出对20S对蛋白酶体的特定抑制剂的抑制剂敏感性，但是在抑制特异性综合底物对TPCK和Chymostatin的特定合成底物的水解活性时观察到了轻微的差异。然而，观察到一个有趣的现象，即TPCK增强了BOC-LEU-ARG-ARG-MCA水解活性，其中20s的激活因子高于R2和DE3。在使用蛋白质底物的一项研究中，R2和DE3几乎不会降解完整的BSA或溶菌酶，但DE3彻底降解了β-蛋白，据说没有固定的三维结构。此外，DE3的降解活性大于20s的羧甲基化溶菌酶（RCM-LZ），并且观察到这些蛋白酶之间的蛋白水解特性差异。因此，已经揭示了R2和DE3的定位位点与20S以及在酶促化学特性方面有多种不同。