消化器癌における多剤耐性遺伝子発現の定量的検討

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今年度は実験系を確立した。MDR、MRPの高発現株であるKB-C2よりRNAを抽出し、mdr-1、mrpの特定領域を増幅させるプライマーを使用してRT-PCR法を行い、増幅後、クローニングした。クローニングしたPCR productを制限酵素処理をしてinternal deletionを作ることによりcompetitorを作成した。mdrのPCRproductのサイズは609bpで、制限酵素NCoI+StuI処理をすることにより、120bp deletionの489bpのcompetitorを作成した。同様にmrpのPCR productは693bpで、BstP1+Stu 1処理をすることにより155bp deletionの538bpのcompetitorを作成した。このcompetitorはそれぞれ、先に使用したmdr、mrpと同じプライマーにて増幅することができ、しかもオリジナルの増幅産物とはproductの長さが異なるため、アガロース電気泳動での判別が可能であった。competitorもクローニングし、濃度を測定し保存した。competitorを既知の濃度(1amol、2amol、5amol、10amol、100amol、1fmol、10fmol、50fmol、100fmol)で添加したPCR tubeに、KBC2より抽出したtotal RNA5μgより作成したcDNAを加えてcompetitive RT-PCRをすることで、KBC2のmdr、mrpを定量的に測定することができた。KBC2を使用した予備実験を行い、PCR条件、PCR回数を決定した。以上により腫瘍のmdr、mrpを定量的に測定するcompetitive PCR法が確立された。現在、川崎医科大学にて手術を施行され、腫瘍が凍結保存されている各種消化器癌症例を対象に、今年度購入した多検体を一度に処理できるオイルフリーPCR装置を使用し、上記により確立された方法でcompetitive PCRを施行し、薬剤耐性遺伝子発現の定量を行っている。