カルパインによるNF-κB転写活性調整の解析

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リコビナントIκBαとNF-κB/IκBαを作成して、μカルパインによるIκBαの切断部位とNF-κB/IκBαからの活性化NF-κBの生成を検討した。1.リコビナントIκBα,NF-κB/IκBα複合体の作成.NF-κBの構成成分であるp50及びp65とIκBαを含むプラスミドから、baculovirusに組み換えを行い、それぞれのベクターウイルスを調整した。これを昆虫細胞sf9に、IκBαウイルス単独、または3種のベクターウイルスを混合感染させて、IκBα及びNF-κB/IκBα複合体を調整した。2.μカルパインによるIκBαの切断.低(20μM〜500μM)カルシウム存在下、常温(20℃)でμカルパインをIκBαに作用させると限定分解がおこり、SDS-PAGE/CBB染色でみられる主要なフラグメントとして32kDaと24kDaの2つのバンドが得られた。このフラグメントのN-末端からは双方とも2種類のアミノ酸配列が得られ、且つ同じであった。これより切断部位はN末端から50番目と53番目のアミノ酸のC端側で切断されることがわかり、さらに32kDaと24kDaのフラグメントの分子量差からC末端にも易切断部位のあることが判明した。3.μカルパインによるNF-κB/IκBαからのNF-κBの生成.リコンビナントNF-κB/IκBαにμカルパインを作用させるとDNAprobeと結合する活性化NF-κBが生ずることがゲルシフト法で証明された。NF-κB/IκBα単独、カルシウム非存在下ではprobeと結合するNF-κBは生成されなっかたが、カルシウム存在下にμカルパインを働かせた場合にはカルシウム濃度依存的にNF-κBの量が増加し、それはカルパイン阻害剤であるZ-LLHやSJA6017で抑制された。以上の結果からNF-κB/IκBα複合体からNF-κBの生成はプロテアソームの系のみならずカルパインによっても生成されることがin vitroの系で証明された。