細胞死にともなう細胞死抑制因子(Bcl-2)の動態に関する研究

细胞死亡抑制因子（Bcl-2）与细胞死亡相关的动力学研究

• 批准号: 00J01327
• 负责人: 金森 市朗
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-00J01327/
• 关键词: アポトーシス; Bcl-2; チトクロームc; ミトコンドリア; PC12細胞; HeLa細胞

平成12年度に採取したヒトbcl-2-GFP遺伝子導入PC12細胞と同遺伝子導入HeLa細胞を免疫組織化学的手法を用いて、観察検討した。すなわち、通常状態で培養したヒトbcl-2-GFP遺伝子導入PC12細胞と同遺伝子導入HeLa細胞、また、細胞死を誘導した後の同細胞(PC12細胞は血清除去24時間後、HeLa細胞はTNF-αにて細胞死を誘導した)を0.1%グルタールアルデヒドならびに4%パラホルムアルデヒド(0.1MPB緩衝液)で固定し、凍結薄切切片を作製し、抗GFP抗体、抗Bcl-2抗体を用いて、免疫染色を施し、電子顕微鏡にて観察を行なった。その結果、通常状態で培養したヒトbcl-2-GFP遺伝子導入PC12細胞と同遺伝子導入HeLa細胞では、いずれの細胞でもBcl-2はミトコンドリアの内外膜、特に内膜に局在し、その他、核膜や小胞体と思われる構造物にも局在していた。一方、細胞死を誘導されたヒトbcl-2-GFP遺伝子導入PC12細胞と同遺伝子導入HeLa細胞では、Bcl-2の局在に変化が起こり、Bcl-2はミトコンドリアの内膜から、ほとんどが消え、ミトコンドリアの周囲に観察された。また、Bcl-2をtime-lapse microscopeで経時的に観察したところ、Bcl-2は顆粒状であった。細胞死を誘導したところ、顆粒状だったBcl-2は細胞質に拡散するように観察された。それぞれの細胞を固定し、免疫染色したところ、チトクロームcは細胞死誘導前はミトコンドリアに局在し、細胞死誘導後は細胞質に流出した。これらのことから、Bcl-2がミトコンドリアから細胞質に移行した後に、チトクロームcがミトコンドリアから流出することが強く示唆された。

In 2012, the bcl-2-GFP gene was introduced into PC12 cells and HeLa cells by immunohistochemical methods. The bcl-2-GFP gene was introduced into PC12 cells under normal culture conditions, HeLa cells were transfected with the same gene, and the same cells were induced after cell death (24 hours after serum removal of PC12 cells, HeLa cells were induced to die by TNF-α). 0.1% of the cells were fixed in 0.1MPB buffer, 4% of the cells were frozen, thin sections were prepared, anti-GFP antibody and anti-Bcl-2 antibody were used, immunostaining was performed, and electron microscopy was performed. As a result, the bcl-2-GFP gene was introduced into PC12 cells under normal culture conditions, and the same gene was introduced into HeLa cells. The Bcl-2 gene was isolated from the inner and outer membranes of the cells, especially the inner membrane, and other nuclear membrane and small cell structures. In addition, the bcl-2-GFP gene was introduced into PC12 cells and HeLa cells, and Bcl-2 gene expression was detected in both cells. Bcl-2 is a time-lapse microscope. Cell death is induced by apoptosis and granular Bcl-2 is detected in cytoplasm. The cells were fixed, immunostained, and the cytoplasm flowed out before and after cell death induction. The expression of Bcl-2 is strongly expressed in the cytoplasm.

项目成果

Kametaka, S et al.: "Identification of phospholipid scramblase 1 as a novel interacting molecule with beta -secretase (BACE)"J Biol Chem. (in press). (2003)

Kametaka, S 等人：“磷脂扰乱酶 1 的鉴定是一种与 β-分泌酶 (BACE) 新型相互作用的分子”J Biol Chem。