Rasを介したRaf-1活性化機構の細胞内可視化解析

Ras介导的Raf-1激活机制的细胞内可视化分析

• 批准号: 00J01861
• 负责人: 日比野 佳代
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-00J01861/
• 关键词: H-Ras; cRaf-1; EGF; GFP; 蛍光顕微鏡; 膜ラッフル; 1分子イメージング

低分子量G蛋自質Rasとその標的タンパク質セリン/スレオニンキナーゼRaf1の相互作用は、細胞増殖、分化において重要な情報伝達反応の一つであるが、増殖・分化刺激後の細胞内における両者の時空間的な情報伝達反応の様相は詳しく解析されていない。そこで、上皮成長因子(EGF)刺激後のRas/Raf1相互作用反応特性を明らかにするため、蛍光タンパク質(GFP)を融合させたRasとRaf1を細胞内で可視化し、多分子平均観察、1分子観察の異なる2つの方法でそれらの挙動を解析した。多分子解析により以下の点が明らかになった。(1)刺激後のRasとRaf1の相互作用反応は細胞膜上で空間的に不均一に起きた。RasとRaf1が特に濃縮して60分以上も反応を持続させる部位が局所的に現れ、そこからは膜ラッフルが形成された。(2)EGFが細胞膜上に均一に結合しているにもかかわらず、一部の細胞膜部位に存在するRasはRaf1と相互作用しなかった。これらは、外部刺激が細胞膜に一様に入力されても、Rasの活性化や、RasからRaf1への情報伝達反応が細胞膜の場所により異なる事を示唆している。一方、1分子解析により、(1)EGF刺激前後に関わらずRasとRaf1は細胞膜と細胞質を行き来し、膜上滞在時間の時定数は数百ミリ〜数秒であった。(2)RasとRaf1の相互作用反応が特に持続した膜ラッフルの様な部位でも、個々のRasやRaf1分子は数秒以内に入れ替わっていた。これらは、個々のRasとRaf1の膜上の相互作用はせいぜい数秒間しか維持されない動的な反応であることを示している。以上の結果から、Ras/Raf1細胞内情報伝達反応は、個々の分子を秒オーダーで入れ替えながら、分子間相互作用反応を局所的に数十分間にもわたり維持する動的で不均一な性質を持つことが明らかになった。

Low molecular weight G protein self-protein Ras and Ras target protein interaction, cell proliferation, differentiation, important information transmission, reaction, reaction. 2 Methods for the analysis of Ras/Raf1 interactions after epidermal growth factor (EGF) stimulation: intracellular visualization, multimolecular average detection, molecular detection of Ras/Raf1 interactions after EGF stimulation. Multi-molecular analysis of the following points is clear. (1)After stimulation, the interaction of Ras and Raf1 is reversed, and the space on the cell membrane is not uniform. Ras Raf1 is concentrated in more than 60 minutes, and the film is formed at the same time. (2)EGF binds uniformly to the cell membrane, and Ras Raf1 interacts with some cell membrane sites. This is because the external stimulus is the entry force of the cell membrane, the activation of Ras, the information of Ras and Raf1, and the interaction between the cell membrane and the external stimulus. 1. Molecular analysis: (1) Before and after EGF stimulation, Ras Raf1 cell membrane, cytoplasm, cell membrane, cell membrane, cell membrane. (2) The interaction between Ras and Raf1 is particularly persistent in the membrane and in the body, and Ras and Raf1 molecules are replaced within seconds. The interaction on the membrane of Ras Raf1 is maintained for a few seconds. As a result, Ras/Raf1 intracellular information transmission reaches the opposite direction, and each molecule has a second to enter the opposite direction, and the number of intermolecular interactions has a tenth to maintain the heterogeneous nature of the movement.

项目成果

Kayo Hibino: "Single-and Multiple-Molecule Dynamics of the Signaling from H-Ras to cRaf-1 Visualized on the plasma Membrane of Living Cells"Chem Phys Chem. (掲載決定). (2003)

Kayo Hibino：“活细胞质膜上从 H-Ras 到 cRaf-1 信号传导的单分子和多分子动力学”Chem Phys Chem（2003 年出版）。