超好熱古細菌「動く遺伝子」の細胞間転移機構の解明とそれを応用した遺伝子改変系開発

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1 古細菌rRNA遺伝子における可動性イントロンの分布パターンの多型解析古細菌の16Sおよび23SrRNA遺伝子内部に多数のイントロンを見いだした。これらの挿入パターンを体系的に比較解析して,近縁種間や同種内の株間におけるイントロン挿入パターンの多型を明らかにし,rRNA遺伝子座においてイントロンが高頻度で挿入されるホットスポットを少なくとも19箇所見いだした。これらを踏まえ,イントロン挿入多型がイントロンの水平伝播によって生じたことを明らかにした。2 イントロン水平伝播の鍵酵素,LAGLIDADG型ホーミングエンドヌクレアーゼ(HE)の性状解析・塩基長が600前後のイントロン内部にopen reading frame(ORF)を見いだし,情報学的解析からこれらがLAGLI-DADGファミリーに属するDNA切断酵素(ホーミングエンドヌクレアーゼ;HE)であると予測した。このうちAeropyrum pernix K1の16Sおよび23SrRNA遺伝子イントロンにコードされるI-ApeIおよびI-ApeIIが,それぞれ19bp,22bpの特定の配列をもつ本鎖DNAを切断するHEであることを実験的に示した。・I-ApeIおよびI-ApeIIの認識配列に塩基置換を導入してDNA切断活性を検討し,これらのHEが標的配列内の特定の数塩基を厳密に認識し,それ以外の塩基は認識がそれほど厳密でないことを示した。・I-ApeIの触媒活性部位と予測されるアミノ酸モチーフ(LAGLIDADGモチーフ)にランダムなアミノ酸置換を導入し,DNA切断活性に必要なアミノ酸残基を同定した。3 古細菌イントロン由来HEのX線結晶構造の解析古細菌Thermoproteus sp. 061株の16SrRNA遺伝子イントロンにコードされるHE(I^Tsp061I)のX線結晶構造を解析しDNA結合表面と考えられるβサドル構造を見いだした。