糸状菌エンドグリコシダーゼの機能改変と糖タンパク質糖鎖のリモデリングへの応用

丝状真菌糖苷内切酶的功能修饰及其在糖蛋白糖链重塑中的应用

• 批准号: 01J02979
• 负责人: 藤田 清貴
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01J02979/
• 关键词: エンドグリコシダーゼ; endo-β-N-acetylglucosaminidase; 糖転移; Endo-M; 複合型糖タンパク質; Endo-BH; Endo-A; 糖鎖工学; 乳酸菌

糸状菌Mucor hiemalis由来のendo-β-N-acetylglucosaminidase (Endo-M)の持つヒト型糖鎖に対する特異的な糖転移能を利用することにより、ウシ膵臓リボヌクレアーゼBだけでなく、カルボキシペプチダーゼY及びインベルターゼに複合型糖鎖を付加させることが出来たことから、種々の糖タンパク質糖鎖のリモデリングが可能であることが確認できた。Endo-Mの反応系にDMSO等の水溶性有機溶媒を添加することで新規な複合型糖鎖を酵素合成する収率を大幅に高めると共に、複合型糖鎖をC-1,C-2位に様々な官能基を付加させた難水溶性のアクセプター基質に糖転移させることに成功した。これにより、Endo-Mの糖転移反応におけるアクセプターの自由度を高め、糖転移反応の有効性を高めることができた。また、Chemical rescueの手法を用いて、endo-β-N-acetylglucosaminidaseの触媒残基の特定を試みた結果、グラム陽性細菌Arthrobacter protophormiae由来のendo-β-N-acetylglucosaminidase (Endo-A)において173番目のグルタミン酸残基が酸-塩基触媒として働くことを明らかにした。さらに、好アルカリ性細菌Bacillus halodurans C-125由来のendo-β-N-acetylglucosaminidase (Endo-BH)のクローニング及び発現を行ったところ、Endo-Aと同様の基質特異性、糖転移活性を有していた。Endo-Aは有していないC末端領域を除いても酵素活性に影響を及ぼさないことから、酵素活性には必須でない領域であり、分泌及び局在に影響を与える領域であることが示唆された。

The endo-beta-N-acetylglucosaminase (Endo-M) derived from Mucor hiemalis has been identified as a specific carbohydrate transport energy for the persistence of a unique carbohydrate lock. Endo-M reaction system is a water-soluble organic solvent such as DMSO, and the enzyme synthesis efficiency of the new complex glycosidic chain is greatly increased. The enzyme synthesis efficiency of the new complex glycosidic chain is greatly increased. The enzyme synthesis efficiency of the new complex glycosidic chain is greatly increased. The enzyme synthesis efficiency of the complex glycosidic chain is greatly increased. The degree of freedom of Endo-M sugar transfer is high, and the degree of sugar transfer is high. In addition, the method of Chemical rescue was used to determine the catalytic residue of endo-β-N-acetylglucosaminidase. The results showed that endo-β-N-acetylglucosaminidase (Endo-A) derived from Arthrobacter protophormia was a positive bacterium. Bacillus halodurans C-125 is a highly pathogenic bacterium derived from endo-beta-N-acetylglucosaminase (Endo-BH), which has the same substrate specificity and sugar transport activity as Endo-A. Endo-A has a C-terminal domain that affects enzyme activity and secretion.

项目成果

藤田 清貴, 山本 憲二: "微生物酵素を用いた糖タンパク質糖鎖の自由なモデリング"化学と生物. 41・4. 244-249 (2003)

Kiyotaka Fujita、Kenji Yamamoto：“使用微生物酶进行糖蛋白糖链的自由建模”化学与生物学 244-249（2003）。

Kato, T, Fujita, K, Takeuchi, M, Kobayashi, K, Natsuka, S, Ikura, K, Kumagai, H, Yamamoto, K: "Identification of an endo-β-N-acetylglucosaminidase gene in Caenorhabditis elegans and its expression in Esclzerichia coli"Glycobiology. 12・10. 581-587 (2002)

Kato, T, Fujita, K, Takeuchi, M, Kobayashi, K, Natsuka, S, Ikura, K, Kumagai, H, Yamamoto, K：“秀丽隐杆线虫中内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的鉴定及其表达大肠杆菌《糖生物学》. 12・10. 581-587 (2002)

Mizutani, K., Okamoto, I., Fujita, K., Yamamoto, K., Hirose, M.: "Structural and functional characterization of ovotransferrin produced by Pichia pastoris."Biosci.Biotechnol.Biochem.. 68・2. 376-383 (2004)

Mizutani, K.、Okamoto, I.、Fujita, K.、Yamamoto, K.、Hirose, M.：“巴斯德毕赤酵母产生的卵转铁蛋白的结构和功能特征”。Biosci.Biotechnol.Biochem.. 68・2。 -383 (2004)

山本憲二, 青木一弘, 牧村 裕, 藤田清貴: "糸状菌の糖鎖工学・糖鎖生物学"日本農芸化学会誌. 77. 42-44 (2003)

Kenji Yamamoto、Kazuhiro Aoki、Yutaka Makimura、Kiyotaka Fujita：“丝状真菌的糖工程和糖生物学”日本农业化学学会杂志 77. 42-44 (2003)。

Akaike, E., Tsutsumida, M., Osumi, K., Fujita, M., Yamanoi, T., Yamamoto.K., Fujita, K.: "High efficiency of transferring a native sugar chain from a glycopeptide by a microbial endoglycosidase in organic solvents."Carbohydr.Res.. 339・3. 719-722 (2004)

Akaike, E.、Tsutsumida, M.、Osumi, K.、Fujita, M.、Yamanoi, T.、Yamamoto.K.、Fujita, K.：“通过微生物从糖肽转移天然糖链的效率很高有机溶剂中的糖苷内切酶。《碳水化合物研究》339・3.719-722(2004)