糸状菌エンドグリコシダーゼの機能改変と糖タンパク質糖鎖のリモデリングへの応用

糸状菌Mucor hiemalis由来のendo-β-N-acetylglucosaminidase (Endo-M)の持つヒト型糖鎖に対する特異的な糖転移能を利用することにより、ウシ膵臓リボヌクレアーゼBだけでなく、カルボキシペプチダーゼY及びインベルターゼに複合型糖鎖を付加させることが出来たことから、種々の糖タンパク質糖鎖のリモデリングが可能であることが確認できた。Endo-Mの反応系にDMSO等の水溶性有機溶媒を添加することで新規な複合型糖鎖を酵素合成する収率を大幅に高めると共に、複合型糖鎖をC-1,C-2位に様々な官能基を付加させた難水溶性のアクセプター基質に糖転移させることに成功した。これにより、Endo-Mの糖転移反応におけるアクセプターの自由度を高め、糖転移反応の有効性を高めることができた。また、Chemical rescueの手法を用いて、endo-β-N-acetylglucosaminidaseの触媒残基の特定を試みた結果、グラム陽性細菌Arthrobacter protophormiae由来のendo-β-N-acetylglucosaminidase (Endo-A)において173番目のグルタミン酸残基が酸-塩基触媒として働くことを明らかにした。さらに、好アルカリ性細菌Bacillus halodurans C-125由来のendo-β-N-acetylglucosaminidase (Endo-BH)のクローニング及び発現を行ったところ、Endo-Aと同様の基質特異性、糖転移活性を有していた。Endo-Aは有していないC末端領域を除いても酵素活性に影響を及ぼさないことから、酵素活性には必須でない領域であり、分泌及び局在に影響を与える領域であることが示唆された。

糸状菌Mucor hiemalis由来のendo-β-N-acetylglucosaminidase (Endo-M)の持つヒト型糖鎖に対する特異的な糖転移能を利用することにより、ウシ膵臓リボヌクレアーゼBだけでなく、カルボキシペプチダーゼY及びインベルターゼに複合型糖鎖を付加させることが出来たことから、種々の糖タンパク質糖鎖のリモデリングが可能であることが確認できた。Endo-Mの反応系にDMSO等の水溶性有機溶媒を添加することで新規な複合型糖鎖を酵素合成する収率を大幅に高めると共に、複合型糖鎖をC-1,C-2位に様々な官能基を付加させた難水溶性のアクセプター基質に糖転移させることに成功した。これにより、Endo-Mの糖転移反応におけるアクセプターの自由度を高め、糖転移反応の有効性を高めることができた。また、Chemical rescueの手法を用いて、endo-β-N-acetylglucosaminidaseの触媒残基の特定を試みた結果、グラム陽性細菌Arthrobacter protophormiae由来のendo-β-N-acetylglucosaminidase (Endo-A)において173番目のグルタミン酸残基が酸-塩基触媒として働くことを明らかにした。さらに、好アルカリ性細菌Bacillus halodurans C-125由来のendo-β-N-acetylglucosaminidase (Endo-BH)のクローニング及び発現を行ったところ、Endo-Aと同様の基質特異性、糖転移活性を有していた。Endo-Aは有していないC末端領域を除いても酵素活性に影響を及ぼさないことから、酵素活性には必須でない領域であり、分泌及び局在に影響を与える領域であることが示唆された。