発生分化過程におけるスプライシング因子SR蛋白質群の機能解析

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SR蛋白質群は広範囲な生物種において高度に保存されているスプライシング必須因子であり、また選択的スプライシングにおいても大きな役割を持っていると考えられている。申請者はこれまでに線虫を用いた解析により、線虫のSR蛋白質が普遍的に発現し、いくつかのSR蛋白質が胚発生や生殖巣の形成、生殖細胞の分化や形成過程に重複した機能を持つ可能性を示した。そこで生体内で相互作用する蛋白質やRNAの探索を試みた。このため目的蛋白質にprotein Aタグが付加された融合蛋白質を線虫内で発現させ、この蛋白質が形成する複合体をprotein AとIgGとの結合により精製する方法を採用した。また、構築したプラスミドの線虫への導入には、通常の手法による生殖細胞での発現抑制を回避するために、近年開発されたmicroparticle bombardment法を利用した。テストケースとして、SR蛋白質と類似した表現型を示すスプライシング関連蛋白質遺伝子を今回構築したベクター系に挿入し線虫に導入した。その結果、生殖細胞でも導入遺伝子が発現することを確認した。次にこの導入遺伝子が内在性遺伝子の機能を相補できることを内在性遺伝子のみを標的とした発現抑制によって確認した。また相互作用する蛋白質をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離したところ、結合が予想される蛋白質の分子量に近似したバンドが確認された。この蛋白質をペプチドマスフィンガープリンティング法により同定し生体内での機能解析を行ったところ、実際にこの相互作用が生体内で重要な機能を持っていることが強く示唆された。これらのことから、今回構築した手法はSR蛋白質の機能を解析する上で有効な手段を提供すると考えられる。