ニワトリ細胞株DT40の温度感受性株の作製とDNA複製チェックポイントの解析

1.DT40細胞におけるRad50条件破壊株の作製Rad50遺伝子は細胞の増殖に必須であることが予想されるので、以下の方法で条件破壊株を作製した。(1)Rad50ヘテロ接合体(+/-)の作製まず一方の対立遺伝子上のRad50遺伝子をヒスチジノール耐性遺伝子の挿入により破壊した。(2)Rad50遺伝子発現コンストラクトの構築とヘテロ接合体への導入テトラサイクリン誘導プロモーターの下流にニワトリRad50cDNAを挿入し、さらにその下流に内部リボゾーマル結合サイト(IRES)とルシフェラーゼ遺伝子を挿入した。さらにこれら全体を2つのloxPシグナルで挟んだベクターを構築した。(培地にタモキシフェンを添加により、エストロジェン受容体-Cre組み換え酵素の融合蛋白(ER-Cre)を発現している細胞では、2つのloxPに挟まれた挿入遺伝子をゲノムから切り出すことが可能である。)このRad50発現ベクターと転写因子(tTA)発現ベクターをRad50ヘテロ接合体に導入した。(3)Rad50ホモ接合体(-/-)の作製もう一方の対立遺伝子上のRad50遺伝子をブラストサイディン耐性遺伝子の挿入により破壊した。また得られたホモ接合体にER-Cre発現ベクターを導入し、Rad50条件破壊株を樹立した。2.Rad50条件破壊株のフェノタイプ解析(1)Rad50条件破壊株は薬剤を含まない培地では正常に増殖したが、ドキシサイクリンまたはタモキシフェンの培地への添加により増殖できなくなった。(2)(1)の処理によりレポーター遺伝子のルシフェラーゼ活性は著しく減少した3.温度感受性Rad50ミュータントcDNAの構築Rad50は中央にcoiled-coil構造を持つSMC様蛋白で、Mre11と複合体を形成する。最近Rad50蛋白の結晶構造解析から3次元構造が明らかになった。構造解析を行った米国のTainer博士との共同研究で、Mre11との蛋白相互作用に温度感受性を示すような変異を予想し、Rad50の特定アミノ酸部位に変異を導入したcDNAを構築している。

1.DT40細胞におけるRad50条件破壊株の作製Rad50遺伝子は細胞の増殖に必須であることが予想されるので、以下の方法で条件破壊株を作製した。(1)Rad50ヘテロ接合体(+/-)の作製まず一方の対立遺伝子上のRad50遺伝子をヒスチジノール耐性遺伝子の挿入により破壊した。(2)Rad50遺伝子発現コンストラクトの構築とヘテロ接合体への導入テトラサイクリン誘導プロモーターの下流にニワトリRad50cDNAを挿入し、さらにその下流に内部リボゾーマル結合サイト(IRES)とルシフェラーゼ遺伝子を挿入した。さらにこれら全体を2つのloxPシグナルで挟んだベクターを構築した。(培地にタモキシフェンを添加により、エストロジェン受容体-Cre組み換え酵素の融合蛋白(ER-Cre)を発現している細胞では、2つのloxPに挟まれた挿入遺伝子をゲノムから切り出すことが可能である。)このRad50発現ベクターと転写因子(tTA)発現ベクターをRad50ヘテロ接合体に導入した。(3)Rad50ホモ接合体(-/-)の作製もう一方の対立遺伝子上のRad50遺伝子をブラストサイディン耐性遺伝子の挿入により破壊した。また得られたホモ接合体にER-Cre発現ベクターを導入し、Rad50条件破壊株を樹立した。2.Rad50条件破壊株のフェノタイプ解析(1)Rad50条件破壊株は薬剤を含まない培地では正常に増殖したが、ドキシサイクリンまたはタモキシフェンの培地への添加により増殖できなくなった。(2)(1)の処理によりレポーター遺伝子のルシフェラーゼ活性は著しく減少した3.温度感受性Rad50ミュータントcDNAの構築Rad50は中央にcoiled-coil構造を持つSMC様蛋白で、Mre11と複合体を形成する。最近Rad50蛋白の結晶構造解析から3次元構造が明らかになった。構造解析を行った米国のTainer博士との共同研究で、Mre11との蛋白相互作用に温度感受性を示すような変異を予想し、Rad50の特定アミノ酸部位に変異を導入したcDNAを構築している。