Gene Gunシステムを用いた副腎皮質刺激ホルモン受容体抗体の作製

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免疫動物の鶏種はwhite leghorn chicken(ハイラインローラ)を用いた。また、鶏のmelanocyeで発現させるためのコンストラクトは、CMVプロモーターを有する一過性発現ベクターpRc/CMV2に、PCR法で得たマウス副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)受容体遺伝子の全コード領域を含むcDNAを組み込んで作製した。初回遺伝子導入は、産卵開始直後の20-22週齢の鶏に、Helios Gene Gunシステムを用いて胸部皮下に行った。即ち、前述コンストラクト100μgを1.0μ及び1.6μ金粒子50mgと混合(polyvinylpyrollidone濃度は0.05mg/ml)し、ヘリウムガス圧400psiの条件下で、ペントバルビタール麻酔下の鶏の脱毛した胸部に1回24shot(1shot当たりのDNA量は1μgで、異なる24箇所へ)を行った(1.0μ金粒子群及び1.6μ金粒子群それぞれ2羽)。初回打ち込みから2週間ごとに同様の打ち込みを行い、現在3回目が終了した。今後さらに1-2回打ち込む予定にしている。3回目以降の各回打ち込み後6、7、8日目の卵からIgYを精製する。抗体の検定は、メラノーマ細胞にGene Gunで用いたと同じACTH受容体cDNAを含むコンストラクトをリン酸カルシウム法で遺伝子導入し、ACTH受容体蛋白を一過性に発現させ、免疫染色法にて確認する予定である。その際、遺伝子導入していないメラノーマ細胞をコントロールとする。実験準備等に時間を要したため予定実験完遂まで至らなかったが、抗体が出来ている確証を得たなら、早期に抗体の性質につき種々検討をする予定である。