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Haloarcula japonica由来フェレドキシンに関する研究

海斑藻铁氧还蛋白的研究

基本信息

批准号：
02J06439
负责人：
松尾高稔
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02J06439/
关键词：
フェレドキシン(Fd)発現系融合タンパク質

项目摘要

申請者は、高度好塩性古細菌Haloarcula japonicaが産生する耐塩性Fdの研究に取り組んでいる。これまでにHa.japonica Fd遺伝子のN末端側に各種Tagを付加した融合タンパク質の大腸菌での発現を試みたが、得られた各融合タンパク質は鉄-硫黄クラスターを含まないアポタンパク質であった。そこで、この[2Fe-2S]型クラスターの挿入には高塩濃度環境が必要であると考え、本研究では、Ha.japonica Fd遺伝子のC末端側にHis-Tagを付加した形の融合遺伝子を構築し、親株を宿主としたHa.japonica Fdの発現を試みた。まず最初にHa.japonica Fd遺伝子を大腸菌-高度好塩性古細菌シャトルベクターpWL102に連結し、発現型プラスミドpJAF18を構築した。ここでは、宿主由来の天然型Fdと組換え型Fdとの区別を目的として、C末端側にHis-Tagを融合した形での生産を試みた。His-Tagを付加した形の融合型Fd遺伝子を宿主であるHa.japonicaへ導入した後、Fd/His-Tag融合タンパク質の産生を調べた。形質転換体から調整した細胞質画分をSDS-PAGEにかけ、抗Fd抗体および抗His-Tag抗体を用いたイムノブロッティング解析を行ったところ、Fd/His-Tag融合タンパク質が産生されていることが明らかとなった。Ha.japonicaが産生したFd/His-Tag融合タンパク質を、陰イオン交換カラム、ゲルろ過およびNi-キレーティングカラムを用い精製した。その結果、SDS-PAGEにおいて単一バンドを示す標品が得られた。そして、精製品の電子スペクトルおよびESRスペクトルの結果から、Fd/His-Tag融合タンパク質が[2Fe-2S]型クラスターを保持していることが明らとなった。

The applicant selected a group for research on the production of resistant Fd from highly pathogenic archaea Haloarcula japonica. The N-terminal side of the Ha.japonica Fd gene contains a variety of tags that are added to the fusion protein and the production of E. coli. In this study, His-Tag was added to the C-terminal side of Ha.japonica Fd gene, and the development of Ha.japonica Fd gene was studied. The original Ha.japonica Fd gene was constructed from Escherichia coli, a highly pathogenic archaea, and pWL102. The origin of the natural Fd is different from that of the C-terminal. After His-Tag is added to the host, Fd/His-Tag fusion is generated. SDS-PAGE analysis of Fd and His-Tag fusion proteins Ha.japonica is produced by Fd/His-Tag fusion, which is refined by using the following methods: quality, negative, exchange, and Ni-type. The results of SDS-PAGE showed that the standard sample was obtained. Fd/His-Tag fusion of the electron spectrum of fine products with [2Fe-2S] type is maintained.