骨代謝・骨粗鬆症治療における骨芽細胞カルシウム感知受容体とその作動薬の役割の解明

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骨芽細胞にはカルシウム感知受容体(CaR)が存在し、Ca2+を感知し、その遊走・増殖能を亢進させるとされている。一方、最近CaRノックアウトマウスにおいて、著明な副甲状腺機能亢進による骨微小環境での高Ca濃度にも関わらず、骨石灰化障害を認めたとの報告があり(Garner SC et a1. Endocrinology 2001)、骨芽細胞におけるCaR発現がその石灰化に不可欠である可能性がある。今回我々は、この点をマウス骨芽細胞様MC3T3-E1細胞を用いてin vitroの系において検討した。マウスCaRの翻訳開始点ATGの5bp上流からの324bpを、MC3T3-E1細胞のcDNAをtemplateにしたPCRで増幅し、pcDNA3ベクターに逆方向に組み込み、CaRアンチセンス(AS)ベクターを作製した。MC3T3-E1細胞にベクターのみ、あるいはCaR-ASベクターをtransfectionし恒常的発現株を作成した。WesternBlot法及びRT-PCR法によりCaR-AS株においてCaR発現低下を確認した。細胞は3週間培養し、ALP活性はALP染色で、石灰化能はb-グリセロリン酸、アスコルピン酸存在化にAlizarin Red法とvon Kossa法にて検討した。加えて、1型collagen(COLI)、osteopontin(OPN)、osteocmlcin(OCN)の発現をNorthern Blot法、及びRT-PCR法にて検討した。CaR-AS株はコントロール株に比べて1週間培養でALP活性の低下、3週間培養で石灰化能の低下を認めた。AS株において骨基質蛋白のうち、COLI、OPNの発現には明らかな差を認めなかったが、OCNの発現は著明な低下を認めた。骨芽細胞は分化段階に応じた骨基質蛋白を分泌し、石灰化の過程へと成熟をとげる。CaR-ASベクター導入による内在性CaR発現低下により、MC3T3-E1細胞において成熟段階で見られるOCNの発現や石灰化能の低下を認めた。このことから骨芽細胞においてCaR発現は、分化後期の石灰化能獲得に重要である可能性がin vitroの系において初めて示唆された。今後、nornal CaR vectorをMC3T3-E1細胞に過剰発現させ、反対にALP活性、OCN発現、石灰化能が亢進するかどうか確認したあと、研究成果を論文発表する予定である。