GFP融合PHドメインによる哺乳動物受精卵のイノシトールリン脂質動態の解析

使用 GFP 融合 PH 结构域分析哺乳动物受精卵中的肌醇磷脂动态

• 批准号: 13770027
• 负责人: 河内 全
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Tokyo Women's Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13770027/
• 关键词: PHドメイン; 受精; Ca^<2+>オシレーション; GFP; PLC; PIP_2; IP_3; IP_3 5-phosphatase; Caオシレーション

PLCδ_1由来のPHドメインはIP_3及びPIP_2に対して特異的に結合し、IP_3対する親和性がPIP_2の20倍である。PLCδ_1由来のPHドメインを持つGFP-PHDδ_1融合蛋白質をプローブとして作製し、同時にGFPuvを用いて2波長励起1波長測光系によるレシオメトリックな卵内のIP_3可視化システムを構築したことを昨年度報告した。両者をマウス成熟卵に顕微注入し、480nmと380nm励起による蛍光強度比を測定すると卵細胞膜に強いシグナルが得られ、プローブはin vivoで細胞膜PIP_2に局在することが観察された。100μM以上のIP_3注入によりプローブは注入直後に細胞質に速やかに拡散し、漸次的に再び細胞膜へ局在した。この移動はIP_3への特異的結合によることが確認されたが、100μM以下のIP_3濃度ではプローブの細胞質への移動が観測されず、Ca^<2+>オシレーションを誘発するのに必要充分であるIP_3濃度(10μM)に感度が満たなかった。プローブが充分な感度を得られなかった点について卵内IP_3濃度が高いことが一因である可能性が考えられた為、IP_3に特異的な脱リン酸化反応を触媒するIP_3 5-phosphaseを用いて以下の検討を行った。IP_3 5-phosphataseの注入による(1)GFP-PHDプローブの卵細胞膜への局在の変化、及び(2)受精時のCa^<2+>オシレーションに与える影響を観察したが、注入時と非注入時で両者に差は見られなかった。卵内のIP_3基底濃度が著しく高い可能性は否定されたが、本実験系で用いた可視化システムを用いて受精時のPLCへの関与を証明することは極めて困難であると結論づけられた。

PLCδ_1 derived from PH has a specific binding affinity for IP_3 and PIP_2. The affinity for IP_3 is 20 times higher than that for PIP_2. PLCδ_1 is derived from the PHD gene and GFP-PHDδ_1 fusion protein is produced. At the same time, GFPuv is used to excite the IP_3 visualization system in eggs. In vivo, the cell membrane PIP_2 was detected by microinjection, 480nm and 380nm excitation. When IP_3 is injected above 100μM, the cytoplasm is rapidly dispersed and the cell membrane is gradually re-injected. The specific binding of IP_3 to the cytosol was confirmed. The sensitivity of the cytosol was detected at IP_3 concentrations below 100μM. The sensitivity of the cytosol was determined at IP_3 concentrations below 10μM. The possibility of high IP3 concentration in eggs due to high sensitivity to IP3 is discussed in the following ways: The effects of IP_3 5-phosphatase injection on (1)GFP-PHD membrane changes during fertilization, and (2) Ca ~(2+) concentration during fertilization were investigated. The basal concentration of IP_3 in eggs is very high, but the possibility of this system is very difficult to visualize and prove.

项目成果

Zen Kouchi: "Spatiotemporal Analysis of Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate and Inositol 1,4,5-Triphosphate in Mouse Eggs Using GFP-PHD"The Japanese Journal of Physiology. 52,Suppl.. S50 (2002)

Zen Kouchi：“使用 GFP-PHD 对小鼠卵中磷脂酰肌醇 4,5-二磷酸和肌醇 1,4,5-三磷酸进行时空分析”《日本生理学杂志》。